一種新的聯合檢測法在水泡狀胎塊診斷及鑒別中的作用

楊周亮 王波 徐元成 周杏元

1.浙江省永康市第一人民醫院病理科，浙江永康321300；2.浙江大學附屬第一醫院病理科，浙江杭州310000

一種新的聯合檢測法在水泡狀胎塊診斷及鑒別中的作用

楊周亮1王波2徐元成1周杏元1

1.浙江省永康市第一人民醫院病理科，浙江永康321300；2.浙江大學附屬第一醫院病理科，浙江杭州310000

目的探討一種新的聯合檢測方法在水泡狀胎塊及相關疾病的診斷及鑒別上的作用。方法回顧性分析42例HM及相關疾病經行HER2 FISH倍體分析及P57、KI67免疫組化檢測。結果42例病例最初的形態學診斷為CHM 11例,PHM 17例和HA 14例，3名富有經驗病理醫師先從形態學進行復診，后結合P57,KI67蛋白表達情況及FISH倍體分析結果，最終診斷為CHM 12例，PHM 14例，HA 16例。初診、復診與最終綜合診斷有26%（11/42）的誤診率。其中初診誤診率為14%（6/42），復診的誤診率為12%（5/42）。結論這種新的聯合方法可以對HM診斷過程中的疑難或易誤診的病例提供較好的診斷依據,是一種新的診斷思路。

水泡狀胎塊；水腫性流產；HER2 FISH倍體分析；P57；KI67

水泡狀胎塊（hydatidiform moles，HM）是較常見的異常妊娠，根據臨床病理學特點可分為完全性水泡狀胎塊complete HM（CHM）和部分性水泡狀胎塊partial HM（PHM）。在病理科的日常工作中經常要與水腫性流產（hydropic abortion，HA）等疾病相鑒別。目前大多數典型的病變根據組織病理學改變以及臨床特點可以準確診斷，但隨著超聲技術的發展，使妊娠第8~12周早期異常病變被提早發現，然而此時的組織學改變不顯著或者相互重疊，給準確的病理學診斷帶來了困難。傳統的細胞遺傳學核型分析和流式細胞DNA倍體分析一直是HM診斷及分類的重要輔助技術，但由于取材需要新鮮的組織，很多情況下難以提供，有時因帶有母體成分而導致信息錯誤，近年來更加敏感特異的熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridization，FISH）開始用于核型分析，HER2作為一種位于17q21.1癌基因，其FISH檢測在乳腺癌中已在國內外廣泛應用，其材料來源可以取自于各個醫院更為容易得到的蠟塊組織，操作技術簡便[1]。為此我們回顧性研究42例水泡狀胎塊及相關疾病的病理形態學特征，并進行HER2 FISH倍體分析及免疫組化P57、KI67蛋白檢測，以探討新方法對上述相關疾病鑒別及診斷的價值和意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集永康市第一人民醫院2012年2月～2013年6月存檔的臨床懷疑HM的病例組織標本42例，均經10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋，HE染色。最初的形態學診斷為11例CHM,17例PHM和14例HA。

1.2 方法

1.2.1 病例診斷全部病例由3名經驗豐富病理醫師根據WHO（2003年）組織學標準，僅從形態學上對上述病例復診，達成一致的診斷,診斷前對原病理診斷均不知情。

1.2.2 HER2 FISH檢測石蠟切片3 μm厚，HER2基因擴增試劑盒購自北京金菩嘉公司，石蠟切片經脫蠟水化后，按照FISH操作流程進行檢測。選取乳腺癌基因擴增病例作為陽性對照，在熒光顯微鏡下主要觀察細胞滋養葉細胞核中紅/綠色熒光信號的分布特點，信號偏弱或缺失的病例重新再做。結果判定[2]：計數50個細胞，紅或綠熒光信號顯示3或4個的細胞數超過10%，則被定義為三倍體或四倍體。

1.2.3 免疫組織化學染色P57、KI67試劑盒購自上海太陽生物制劑公司，所有標本均經過10%福爾馬林固定、常規脫水、石蠟包埋、4 μm切片，采用免疫組化（EnVision兩步法），結果判定：P57蛋白陽性定位于細胞核，呈棕色顆粒，觀察細胞滋養細胞和絨毛間質細胞核表達情況。陽性細胞數<10%，為陰性；陽性細胞數在10%～30%之間為陽性；陽性細胞數>30%，為強陽性[3]。以蛻膜及絨毛外滋養細胞核P57蛋白陽性表達作為陽性內對照。僅有絨毛外滋養細胞表達，則不能認定為陽性。國外有研究發現P57表達很有特點，對于大多數病例P57表達在細胞滋養細胞和絨毛間質細胞中呈彌漫陽性，或陰性，所以可以不用計數評估陽性率，顯微鏡下觀察就可快速評估[4]。KI67陽性定位于細胞核，呈棕色顆粒，主要表達在細胞滋養細胞和部分絨毛間質細胞，合體滋養葉細胞幾乎不表達。平均每張切片計數100個細胞，陰性：陽性細胞數為0；+陽性細胞數≤25%；++陽性細胞數26%～50%；+++陽性細胞數＞50%[5]。

1.2.4 綜合分析結合P57及KI67免疫組化以及HER2 FISH分析結果重新評估對所有病例做出綜合診斷。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS18.0進行數據分析，計數資料采用Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE切片形態學復診結果

12例CHM，15例PHM，15例HA。與初診相比，有11例診斷不同。

2.2 FISH檢測

共42例，有3例信號無法獲取。39例成功病例中12例三倍體，其余全是二倍體，沒有發現四倍體。

2.3 42例病例P57檢測結果

（圖1、2、3）10例陰性，32例陽性病例中2例陽性范圍在10%～30%，其余均呈彌漫陽性>30%，KI67結果強陽性（+++）8例，陽性（++）15例，弱陽性（+）19例。

圖1 PHM中P57染色細胞滋養葉細胞及絨毛間質細胞（+）

圖2 HA中P57染色細胞滋養葉細胞及絨毛間質細胞（+），對照游離滋養葉細胞團（+）

圖3 CHM中P57染色細胞滋養葉細胞及絨毛間質細胞（-），對照蛻膜細胞（+）

表142 例患者KI67、P57蛋白表達情況及FISH檢測結果

2.4 綜合分析

結合P57、KI67免疫組化及HER2 FISH分析結果重新評估對所有病例做出綜合診斷（見表1）。42例病例最終診斷為12例CHM，14例PHM和16例HA。初診、復診與最終綜合診斷仍有26%（11/42）的誤診率。其中初診誤診率為14%（6/42），復診的誤診率為12%（5/42）。這些差異中除1例初診時診斷為HA，最終修正為CHM外，其余10例的差異主要是PHM和HA兩組之間。

3 討論

水泡狀胎塊和水腫性流產鑒別與診斷在實際工作中對臨床治療以及預后有重要的實際意義，在病理科的日常工作中也是一個難點[4]。目前HM診斷和分型主要以臨床表現與組織學特點為判斷標準，組織病理學診斷在很多情況下帶有一定的個人主觀性，不同醫師的診斷水平以及經驗都有差別，可重復性差。國外Benjamin R等[6]的一組66例病變的資料報道，初診與復診有19例不同，誤診率為29%。我們的實驗中初診和復診都是形態學診斷，兩次診斷之間有26%的差錯率，與最終綜合診斷的誤差率分別為14%和12%。這種錯誤和延遲診斷可能會對婦女造成嚴重的后果，而過度診斷也會導致患者焦慮擔心和不必要的花費，所以有必要尋求一些新的技術來提高對早期妊娠期HM以及相關病變的診斷和分類的認識，減少誤診。

FISH方法應用于HM是基于這幾年學術界普遍認可的HM發生的遺傳學基礎[7]，CHM是與母系無關的二倍體核型，而PHM是三倍體，其中一倍體源于母系，一般的HA則擁有屬于父系和母系的二倍體核型。FISH方法目前在乳腺癌HER2基因擴增上應用較廣泛，操作簡便嫻熟，實驗環境也相對穩定。HER2基因擴增試劑有HER2位點和17號染色體著絲粒探針信號，熒光免疫標記出現兩個紅/綠色信號，就可以判定為二倍體，相應的三、四個信號就可以判定為四倍體。

本次研究發現有2例最終診斷結果為PHM的病例FISH檢測結果顯示為二倍體，分析原因可能是收集信號時收集的是蛻膜組織而不是絨毛組織，應該在雜交試驗前將富于絨毛的區域圈起來，但是在很多情況下我們取材所得到的組織是蛻膜和絨毛混在一起。當組織切片上的信號不一致的時候，應該收集信號比較多且比較強的區域。還有一種解釋[8]就是切片僅僅只是細胞一個平面，而細胞本身是一立體結構，細胞核染色體未完全暴露。

P57基因為父源性基因印跡，母源性基因表達，是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinases inhibitors，CDK I）的一員，參與細胞周期調控、促進凋亡、誘導分化[9]。CHM為空卵受精，只有父系基因而無母系基因，故不表達P57。PHM是由一個母系和兩個父系單體基因構成的三倍體，可表達P57。HA是正常二倍體核型，亦可表達P57。目前國內外報道[2，9，10]的文獻來看，P57在HM相關疾病的鑒別上有一定的價值，我們的實驗也支持這一觀點。本次實驗中一病例在初診時被診斷為HA，這例患者停經49 d來院就診，HCG水平不高，大體取材時顯示片狀蛻膜上有7 mm范圍的孕囊泡，HE特點顯示只有數個部分絨毛組織，個別有水腫中央池可見，灶性區滋養葉細胞略有增生，絨毛間質黏液變性明顯。形態學上確實很難區分到底是HM還是HA，這時P57蛋白染色可以輔助診斷。然而還是有個別病例P57染色結果與最終診斷結果有出入，CHM中P57蛋白有表達，可能的解釋有兩種：一是P57基因屬于不完全印跡基因，主要表達在母系等位基因，但父系等位基因也會有少量表達[11]。另一種解釋有些病例可能是一種家族性的常染色體隱性遺傳疾病[12，13]。

從目前的研究來看，PHM和HA的鑒別還是有難度的，因為大部分的最終診斷差異集中在這二者中，這時KI67[14]抗原作為一種判斷細胞增值活性的標記物就具有鑒別提示意義，因為HA是屬于退行性改變，滋養葉細胞增生一般不明顯，而PHM通常伴有滋養葉細胞增生的表現。本次研究表明KI67抗原在PHM表達水平比HA中高，差異有統計學意義。

因此一般情況下對于多數病例倍體分析結果可以幫助我們鑒別出PHM，但不能夠鑒別CHM和HA，P57免疫組化檢測結果在很大程度上解決了這個問題，二者聯合診斷可以使一些妊娠第一個三月內的異常病變，尤其是形態學上很難做出鑒別的病變得到確診。然而還是存在少數病例診斷有困難，這時可以加上輔助標記物KI67、P53[15]等。由此看來今后在HM及相關疾病的臨床病理診斷上我們可以嘗試按照如圖4所示的診斷思路來進行。

圖4 HM及相關疾病臨床病理診斷步驟

[1]楊月紅，袁靜萍，文登虎.乳腺癌石蠟組織FISH檢測預處理方法[J].臨床與實驗病理學雜志，2013，29（1）：105-106

[2]LeGallo RD，Stelow EB，Ramirez NC，et al.Diagnosis of hydatidiform moles using p57 immunohistochemistry and HER2 fluorescent in situhybridization[J].Am J Clin Pathol，2008，129（5）：749-755.

[3]Kuang-Hua Chen，Sheng-Chi Hsu，Hou-Yu Chen.Utility of fluorescence in situ hybridization for ploidy and p57 immunostaining in discriminating hydatidiform moles[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2014，446（2）：555-560

[4]Thomas G，McConnell MD，Kathleen M，et al.Diagnosis and subclassification of hydatidiform moles using p57 immunohistochemistry and molecular genotyping[J].Am J Surg Pathol，2009，33（6）：805-817.

[5]Fatemeh Atabaki Pasdar，Alireza Fazel.Ki-67 expression in hydatidiform moles and hydropic abortions[J].Iranian Red Crescent Medical Journal，2013，15（7）：590-594.

[6]Benjamin R，Ketterling MD，Oberg TN，et al.Comparison of fluorescence in situ hybridization，p57 immunostaining，flow cytometry，and digital image analysis for diagnosing molar and nonmolar products of conception[J].Am J Clin Pathol，2010，133（2）：196-204.

[7]回允中主譯.婦產科診斷病理學[M].北京：北京大學醫學出版社，2007：1023-1026.

[8]Joseph M，Letizia S，Berger E，et al.Assessment of Her-2/ neu expression in hydatidiform moles for prediction of subsequent gestational trophoblastic neoplasia[J].Gynecologic Oncology，2007，104（3）：675-679.

[9]陳云新，沈丹華，顧以群，等.P57和P53蛋白在水腫性流產及葡萄胎鑒別診斷中的作用[J].中華病理學雜志，2011，40（10）：694-697.

[10]張燕，王一，王建華.幾種蛋白檢測在水泡狀胎塊病理診斷與分型中的價值[J].中國婦幼保健，2014，（29）：2446-2449.

[11]Russell V，MD Mamta G.Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles：Ancillary techniques（p57 Immunohistochemistry and molecular genotyping）improve morphologic diagnosis[J].Surg Pathol，2012，36（3）：443-453.

[12]Natalia B，Pei Hui.New diagnostic modalities in the histopathological diagnosis of hydatidiform moles[J].Diagnostic Histopathology，2012：201-209.

[13]Dixon Ph，Tronqwongsa P，Abu-Hawah S，et al.Mutations in NLRP7 are associated with diploid biparental hydatidiform moles，but not androgenetic complete moles[J].J Med Genet，2012，49（3）：206-211.

[14]鐘萍萍，顧以群，孫云飛，等.p57、p53和ki67蛋白在葡萄胎診斷中的價值[J].診斷病理學雜志，2014，21（6）：391-394.

[15]陳昊斌，孫昆昆，戴琳，等.水泡狀胎塊中p57、p53及KI67的表達及意義[J].中國性科學，2014，23（4）：26-30.

A new kind of combined method appling in hydatidiform moles disease diagnosis and identification

YANG Zhouliang1WANG Bo2XU Yuancheng1ZHOU Xingyuan1
1.Department of Pathology,the First People's Hospital of Yongkang City in Zhejiang Province,Yongkang321300, China;2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang University,Hangzhou310000,China

Objective To attempt a new combined method applying in hydatidiform moles(HM)and related disease diagnosis and identification.Methods A diagnosis and differentiate of 42 cases of HM and related disease through immunohistochemical test of P57 and KI67 and HER2 FISH ploidy were retrospectively analyzed.Results The original morphologic diagnosis of the 42 cases included 11 complete HMs(CHM),17 partial HMs(PHM),and 14 hydropic abortion(HA).Three experienced pathologists did secondary diagnosis from morphology.After combining P57,KI67 protein expression and FISH ploidy analysis results,the pathologists determined the final diagnosis including 12 CHM cases,14 PHM cases and 16 HA cases.There was disagreement between the original,secondary and final diagnosis,the misdiagnosis rate was 26%(11/42).The original and final diagnosis had 6 different cases,the misdiagnosis rate was 14%(6/42), the second misdiagnosis rate was 12%(5/42).Conclusion The new combined method may be useful ancillary studies to aid in the diagnosis and classification of HMs,especially to the difficult or easy to be misdiagnosed cases.The method is a new thought of diagnosis.

Hydatidiform moles（HM）；Hydropic abortion(HA)；HER2 FISH ploidy analysis；P57；KI67

R737.33

B

1673-9701（2015）24-0080-04

2015-03-26）

浙江省永康市科技計劃項目（2012-35）