融合蛋白CR2-GDH固定化及不對稱還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯

王爽，穆曉清，聶堯，張榮珍，徐巖

（江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

融合蛋白CR2-GDH固定化及不對稱還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯

王爽，穆曉清，聶堯，張榮珍，徐巖

（江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

比較介孔分子篩材料SBA-15、MCM-41、海藻酸鈣、改性二氧化硅4種載體固定化融合蛋白CR2-GDH其酶固載量和酶活回收率，選擇SBA-15為固定化載體。研究固定化條件對固定化融合酶量的影響以及固定化酶的穩定性，固定化酶在雙相體系催化不對稱還原反應。結果表明，在pH值為5.5、酶濃度為1.4mg/mL、反應1h條件下，固定化酶量為27.7mg/g。加入25mmol/L的Ca2+，固定化酶的酶活回收率由58.6%提高到78.1%。與游離酶相比，固定化酶的熱穩定性顯著提高，40℃條件下酶活回收率提高19.1%。固定化酶水相中反復使用7批次后，剩余活性仍超過30%，具有較好的操作穩定性。與游離酶相比，固定化酶更耐受烷烴類有機溶劑。在水/有機溶劑雙相反應體系中，Ca2+/SBA-15固定化酶和游離酶催化相比，產物得率提高23.8%。

融合蛋白；SBA-15；固定化；雙相體系；不對稱還原

氧化還原酶不對稱還原制備手性醇具有綠色高效和成本低廉等優點，是近年來國內外手性合成的研究熱點，但氧化還原酶對昂貴的輔酶等當量需求限制了其工業化規模應用[1]。利用多基因共表達和融合表達技術，構建具有輔酶酶法耦聯再生的一鍋法反應體系，是目前最為有效的解決途徑，而葡萄糖脫氫酶能夠通過氧化葡萄糖生成NAD(P)H從而實現輔酶再生，研究較為廣泛[2-3]。

利用融合表達技術得到的融合蛋白是一種具有輔酶再生能力的多功能蛋白，不僅可以克服利用多基因共表達構建全細胞催化劑帶來的底產物傳質阻力，也可以減少雙酶偶聯催化反應中兩種催化劑的兩步純化成本[4]，具有重要的潛在工業應用價值。利用固定化技術不僅能夠實現融合蛋白的重復利用，同時也可以有效改善其穩定性。與目前成功實現的氧化還原酶多酶共固定化[5]相比，融合蛋白固定化過程簡單、成本低，是多酶復合反應體系的研究熱點。由于氧化還原酶在固定化過程中酶活性容易受到固定化載體的修飾作用而失活，因此目前氧化還原酶主要采用對酶活力影響較小的吸附法[6]。具有高比表面積和規則有序孔道結構的新型介孔分子篩材料，廣泛應用于吸附法固定化[7]。Humphrey[8]和董穎超[9]等利用修飾后SBA-15實現了胰蛋白酶固定化，明顯提高了操作穩定性和熱穩定性，后者通過固定化酶催化，使反應6批次后剩余活性仍超過40%。

本文基于陳星星[10]對羰基還原酶CR2和葡萄糖脫氫酶GDH雙酶偶聯不對稱還原4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（S-CHBE）的研究，將前期表達的融合蛋白CR2-GDH通過固定化載體的選擇和固定化條件優化，實現融合蛋白的固定化，并考察其熱穩定性、操作穩定性、有機溶劑耐受性，為其工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

介孔分子篩材料SBA-15、MCM-41，南京吉倉納米科技有限公司；改性二氧化硅，四川大學功能高分子實驗室提供；海藻酸鈣，自制。

COBE、(S)-CHBE，Sigma-Aldrich公司；正己烷、異丙醇（色譜純），damas beta公司；酵母膏、蛋白胨，英國Oxoid公司；其余試劑，中國醫藥集團。

高速冷凍離心機，美國Sigma公司；XC92-11DN超聲破碎儀，南京新辰生物科技有限公司；pH 計、AB204-E分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；AKTA purifier，美國GE公司；酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；高效液相色譜儀（HPLC），6820A氣相色譜儀（GC），美國Agilent公司。

1.2 菌種及培養方法

實驗菌種：E. coliBL21/pET-cr2-linter-gdh由作者自己構建。

LB培養基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，使用前加入氨芐青霉素至終濃度100mg/L，卡那霉素至終濃度50mg/L。

挑取重組菌株性E. coliBL21/ pET-cr2-linter-gdh單菌落接種于5mL的LB液體培養基中（卡那抗性，200r/min，37℃振蕩培養12h，按2%的接種量轉接于50mL LB液體培養基中（卡那抗性），200r/min，37℃振蕩培養至OD600為0.6～0.8后，加入誘導物異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）1mmol/L，于17℃下誘導培養10h；10000r/min離心10min并收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次。

1.3 融合蛋白的純化

將誘導表達后離心獲得的E.coliBL21(DE3)/ pET-cr2-linter-gdh濕菌體用緩沖液A（100mmol/L磷酸鉀，150mmol/L NaCl，5mmol/L 咪唑）懸浮，超聲破碎，離心取上清液待上樣進行純化。用緩沖液A平衡鎳柱10min 后上樣，先用緩沖液A將未結合的蛋白洗脫下來，再用 0～500mmol/L的咪唑緩沖液進行梯度洗脫，收集洗脫液測定酶活，并用SDS-PAGE 檢驗蛋白純度。

1.4 融合蛋白的酶活和蛋白質含量測定

羰基還原酶CR2的酶活測定條件：總反應體系0.1mL，包括0.1mol/L乙酸緩沖液（pH值5.5），1.2mmol/L NADPH，20mmol/L COBE以及適量酶液。

葡萄糖脫氫酶GDH的酶活測定條件：總反應體系0.1mL，包括0.1mol/L乙酸緩沖液（pH 值5.5），1.2mmol/L NADP+，10mmol/L 葡萄糖以及適量酶液。

上述皆在340nm處測定吸光度的變化。

酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘催化1μmol NADP+還原所需的酶量或每分鐘催化1μmol NADPH氧化所需的酶量。

蛋白質含量測定采用Bradford法。

1.5 固定化融合蛋白CR2-GDH的制備

取一定量的介孔分子篩材料SBA-15加入到一定濃度的融合蛋白溶液中，將裝置置于搖床中，200r/min 振蕩一定時間后，將溶液以12000r/min速度離心5min，保留上清液，沉淀用緩沖液洗滌多次，直到檢測不到蛋白為止，制得固定化酶，由式（1）、式（2）計算固載率和固載量。

式中，A0為固定化前的融合蛋白量；A1為固定化后上清融合蛋白量，m給酶量為總的給酶量；m載體為載體的質量。

1.6 金屬離子對固定化融合蛋白其酶活回收率的影響

用游離酶、相同量游離酶制得的固定化酶、添加25mmol/L Ca2+固定化酶進行催化反應，以游離酶表現出的活性為100%，測得固定化酶的酶活回收率和Ca2+對酶活回收率的影響。

1.7 固定化融合蛋白熱穩定性的測定

在不加底物的條件下，將游離酶和固定化酶在不同溫度下溫育1h，然后進行催化反應，以比較酶固定化前后酶活性的變化。以放在4℃下游離酶和固定化酶為對照100%。

1.8 固定化融合蛋白水相中操作穩定性的測定

第一次反應體系：62.5mmol/L底物COBE，表現出4U的固定化酶。反應產率為100%時，反應時間為2h。對固定化酶已完成催化反應的體系離心分離，用緩沖液清洗固定化酶2～3次，重新進行催化反應，反應時間和第一次完成催化反應的時間一致（2h），定為反應一次。重復上述操作，比較固定化酶表現出酶活隨使用次數的變化情況。

1.9 固定化融合蛋白有機溶劑耐受性的測定

取一定濃度的游離酶和相同濃度游離酶固定化后的固定化酶，按照1∶1的體積比（游離酶∶有機溶劑）分別添加不同有機溶劑（正己烷、正辛烷、壬烷、仲辛醇、異丙醇、苯甲醇、異丁醇、丙酮、乳酸乙酯、乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯），固定化酶加入與游離酶中相同體積的有機溶劑，于25℃、200r/min 的搖床中震蕩1h，將溶液離心分離，棄除有機溶劑，將游離酶和固定化酶進行催化反應，從而測定不同有機溶劑對融合蛋白的影響。以不進行任何處理的游離酶和固定化酶為對照，活性均為100%。

1.10 固定化融合蛋白雙相反應體系催化COBE

模式1：起始雙相反應體系2mL，COBE濃度125mmol/L，4U游離融合蛋白，反應10h。

模式2：起始雙相反應體系2mL，COBE濃度125mmol/L，表現出4U的固定化酶，反應10h。

模式3：起始雙相反應體系2mL，COBE濃度125mmol/L，表現出4U的固定化酶，25mmol/L的Ca2+，反應10h。

1.11 固定化融合蛋白在雙相反應體系中重復使用性

反應體系：雙相反應體系2mL，底物COBE為62.5mmol/L，表現出4U的固定化酶，第一次反應8h，反應完全。按照1.8節中的方法，對其重復使用。

1.12 產物得率及光學純度檢測

檢測產物得率及光學純度的方法參考樂庸堂等[11]報道的方法。

2 結果與討論

2.1 固定化載體的選擇

氧化還原酶固定化方法主要有吸附法、包埋法、包埋和交聯法共用等[12-14]。在這幾種固定化方法中，吸附法因其對酶活力損失影響最小且不會對酶產生化學修飾廣泛研究[6]。本研究主要選用4種載體SBA-15、MCM-41、改性二氧化硅、海藻酸鈣包埋對融合蛋白進行固定化研究，考察吸附法和常用的海藻酸鈣包埋法對融合蛋白固定化的影響。其中3種載體SBA-15、MCM-41、改性二氧化硅加入20mg，酶量為0.6mg。制備海藻酸鈣1.05g，加入融合酶量34.6mg。

介孔分子篩材料作為酶固定化載體方面表現出優越性，源于孔徑均一、孔道內富含弱酸性羥基。表1中蛋白固載量和酶活回收率表明不同的固定化材料對氧化還原酶固定化效果具有較大的影響，介孔分子篩材料SBA-15和MCM-41的固定化效果好于其他兩種載體固定化，不僅蛋白固載量超過23mg/g，其最終酶活回收率分別達到49.5%和42.4%。SBA-15與MCM-41相比，孔徑更大、孔壁更厚，而且具有機械強度高、無毒、耐酸堿、水熱穩定性好、成本低等特性[15]，因此選擇SBA-15作為固定化材料進行研究。

表1 不同載體固定化融合蛋白

2.2 介孔分子篩材料SBA-15固定化融合蛋白

2.2.1 pH值對固定化酶量的影響

緩沖液pH值的變化可以改變處在緩沖液中的酶分子和固定化載體的離子化狀態，影響酶和固定化載體的結合。因此緩沖液pH值是影響融合酶固定化關鍵因素之一。

由圖1可以看出，在中性偏堿性條件下，固定化融合蛋白固載量受到較大影響，隨著pH值的上升顯著下降。在酸性條件下（pH值 5.0～6.0），固定化酶量最大，為25.5mg/g。在不同pH值條件下，固定化酶催化活力也隨著pH值的變化而變化。用pH值為6.0的磷酸鉀緩沖液制備的固定化酶活力最大，為9.3U/g（g為載體的質量），pH值為5.5緩沖液中制備的固定化酶活力9.1U/g。同時研究表明，固定化酶活力與固定化前所處水溶液的pH值有關。前期研究表明融合蛋白的最適作用pH值為5.5，因此確定固定化最佳條件為pH值為5.5。

圖1 pH值對固定化酶量和酶活力的影響

2.2.2 酶濃度對固定化酶量的影響

融合蛋白濃度與固定化載體上的結合點具有飽和性。在一定范圍內，載體固載量隨著融合蛋白濃度的增加而增加；當融合蛋白濃度超過固定化載體上的結合點時，酶分子之間的活性位點相互作用，降低固載率和固定化酶活力。

從圖2中得出，當酶濃度低于1.4mg/mL時，隨著酶濃度的增加，材料的吸附量呈線性增加，固載率維持在96%以上；當酶濃度超過1.4mg/mL時，融合蛋白固定量飽和，固載率線性下降。綜合考慮固載量和固載率，當酶濃度為1.4mg/mL時固定化效果較佳，此時酶的固定量為27.7mg/g。

圖2 酶濃度對固定化酶量的影響

2.2.3 時間對固定化酶量的影響

在吸附開始階段，由于一部分融合酶分子與介孔分子篩材料孔口及靠近孔口孔道內的羥基作用，融合酶分子停留在載體的孔口處，另一部分酶分子需克服擴散阻力才能進入到介孔分子篩的孔道內部，所以研究時間對載體吸附酶量的影響至關重要。以SBA-15為載體，在酶濃度為1.4mg/mL時考察不同固定化時間載體對固定化酶的吸附量影響，結果見圖3。

圖3 固定化時間對固定化酶量的影響

由圖3可知，介孔分子篩材料吸附的酶量隨時間延長逐漸增加，當吸附時間為1h時，固定化酶量達到最大值27.7mg/g。再延長時間，載體吸附的酶量不變，載體已達到吸附飽和。

2.2.4 金屬離子Ca2+對固定化融合蛋白活性的影響

在對影響固定化的條件優化后，其固定化酶量達到最大值。固定化酶表現的活性也是另一主要研究目標。在催化氧化還原反應時，許多氧化還原酶需要金屬離子的參與，有些金屬離子可以激活或抑制氧化還原酶的活性[16]。

25mmol/L的Ca2+可以提高游離融合酶的活性，所以在固定化酶水相催化反應中添加金屬離子，研究其對固定化酶活性的影響。本研究以相同條件下，游離酶催化反應的活性為100%，結果如表2。從表2中得到，固定化后酶的活性為游離酶的58.6%，加入25mmol/L Ca2+后活性為游離酶的78.1%，提高近20%。金屬離子對固定化酶存在一定的激活作用。

表2 Ca2+對固定化酶的酶活回收率影響

2.3 固定化酶的穩定性

2.3.1 熱穩定性

許多研究表明，固定化操作能夠有效提高酶蛋白的剛性結構，從而有效提高固定化酶的熱穩定性。研究比較了30～60℃下固定化融合蛋白和游離蛋白的催化活力。

由表3可知，游離酶經熱處理后，酶活性顯著下降，30℃酶活只有89.3%，但是固定化酶保持97.3%的活性。在高溫條件下（大于50℃）固定化酶和游離酶都幾乎失去活性。整體看固定化酶的熱穩定性有所提高。這可能是由于一方面介孔分子篩孔道結構提供給酶分子不易受外部環境影響的微環境，另一方面孔道表面的弱酸性羥基能夠保護酶分子的構象不易被高溫破壞[9]。

表3 固定化酶及游離酶熱穩定性影響

2.3.2 水相中操作穩定性

固定化酶可從反應系統中分離，從而實現其重復利用，固定化酶的操作穩定性是評價固定化酶的重要參數。

由圖4可知，固定化酶在使用5次后，依舊保持50%以上的相對活性，連續反應7批次后酶剩余活性仍保持在30% 以上，說明采用介孔分子篩材料為載體制備的固定化酶具有較好的操作穩定性。

圖4 固定化酶的操作穩定性

2.3.3 有機溶劑耐受性

采用融合蛋白CR2-GDH催化COBE為S-CHBE模式反應。高濃度的底物和產物對酶有毒害和抑制作用，且底、產物在單一水相中溶解度低，一般構建水/有機溶劑雙相反應體系以克服上述問題。探討固定化酶對有機溶劑的耐受性至關重要。

有機溶劑的lgP值（疏水常數）是溶劑在正丁醇/水體系中分配常數的對數值，是評價有機溶劑對酶催化劑影響的一個重要參數[10]。

實驗中，將游離酶和固定化酶分別放在有機溶劑中，有機溶劑分為烷烴類、醇類、酯類、丙酮等。從表4中可以看出，固定化酶在有機溶劑耐受性方面較游離酶有一定優勢，對于烷烴類有機溶劑，固定化酶在正己烷、正辛烷、壬烷中放置后，其相對活性仍然保持76.6%、70.4%、72.5%，游離酶則是維持29.7%、38.1%、36.5%的活性。在所選的醇類物質中固定化酶和游離酶活性受到抑制，但是在仲辛醇中游離酶和固定化酶表現出90%以上的活性，源于仲辛醇的lgP值大于其他幾種醇。酯類有機溶劑中，對于高lgP的鄰苯二甲酸二丁酯，固定化酶可以保持91.1%的活性，固定化酶和游離酶在其余兩種較低lgP的酯類中完全失去活性。

表4 固定化酶的有機溶劑耐受性

2.4 固定化酶雙相反應和雙相體系中重復使用性

2.4.1 固定化酶雙相反應

由研究報道，采用吸附法固定的固定化酶適于在有機相中催化反應，可以解決水相中酶脫落導致下游產物分離的難題[6，17]。根據1.9節中固定化酶的有機溶劑耐受性實驗，發現固定化酶在鄰苯二甲酸二丁酯中的酶活性依舊保持91.1%。而且文獻報道底物COBE、產物S-CHBE在鄰苯二甲酸二丁酯中的分配系數為6.2、4.2[18]。所以本研究選擇鄰苯二甲酸二丁酯為有機相，進行后續研究。鑒于Ca2+在固定化酶水相中可以提高固定化酶的活力回收率，所以在有機相中也添加25mmol/L的Ca2+來研究其影響。結果見圖5。

圖5 雙相中不同反應體系催化還原COBE的時間過程曲線

研究結果表明，在相同反應條件下，3種反應體系的產物得率有不同程度的提高（44.9%～68.7%）。圖5 所示為3種反應體系催化還原COBE的時間過程曲線。可以看出，在反應前2h，3種反應體系反應都十分迅速，之后酶在反應體系中會失去部分活性，得率變化不明顯。游離酶在4h 后產物得率逐漸趨于平緩，固定化酶的產率仍有一定的提高，可見固定化酶和游離酶相比，有機溶劑耐受性更強。對于添加25mmol/L的Ca2+的反應體系，在反應前2h內，得率遠高于其他兩種體系，最終的產物得率達到68.7%。反應產物的光學純度都>99.9%。

2.4.2 固定化酶在雙相體系重復使用性

結合2.3.2節中固定化酶在水相中操作穩定性和2.4.1節中固定化酶在水/有機雙相中的催化研究，固定化酶在雙相體系中的重復使用性研究至關重要。

圖6 雙相中固定化酶重復使用性

由圖6可知，固定化酶可以實現雙相中重復使用。隨著固定化酶使用次數的增加，相對剩余活力為下降趨勢。固定化酶在雙相體系中連續催化反應7次，相對酶活力依舊保持70.3%。相比于在水相中的穩定性，固定化酶在有有機介質中酶穩定性顯著增加，源于底物在固定化酶和有機介質中分配，疏水性底物在載體周圍濃度較低。

3 結 論

介孔分子篩材料SBA-15可作為固定化融合蛋白CR2-GDH的較佳載體。材料為10mg，控制酶蛋白濃度為1.4mg/mL，pH值為5.5，固定化時間為1h，此時固載量為27.7mg/g。加入25mmol/L的Ca2+，可以提高固定化酶的酶活回收。

和游離酶相比，固定化酶的熱穩定性、有機溶劑耐受性有所提高。固定化酶連續反應7批次后酶剩余活性仍保持在30% 以上，而游離酶不能達到多批次利用的效果。

選擇鄰苯二甲酸二丁酯為有機相，進行固定化酶催化雙相反應。添加25mmol/L的Ca2+的固定化酶反應體系，產物得率比游離酶體系提高23.8%。固定化酶在雙相中可以實現多批次使用，重復使用7次后，相對活性依舊保持70.3%。

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Immobilization of fusion enzyme CR2-GDH and bioreduction of ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate

WANG Shuang，MU Xiaoqing，NIE Yao，ZHANG Rongzhen，XU Yan
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Mesoporous molecular sieves SBA-15 was the best one among 4 kinds of carriers in terms of both carrier content and recovery of enzyme activity. The remaining carriers were MCM-41，modified silica，and calcium alginate. Immobilization of fusion enzyme CR2-GDH on SBA-15 was realized，and effect of immobilization conditions on immobilization content and activity，stabilization of immobilized enzyme，asymmetric reduction in biphasic system was investigated. The results showed that adsorption capacity was 27.7mg/g carrier under the condition of pH5.5，enzyme concentration 1.4mg/mL，reaction time of one hour. The recovery of immobilized enzyme activity was increased by near 20% adding metal ion Ca2+of 25mmol/L. It was also found that the thermal and operational stabilities of the immobilized enzyme were higher than those of free enzyme. The recovery was increased by 19.1% at the temperature of 40℃. Immobilized enzyme was not more sensitive to organic solvents especially alkanes than free enzyme. In biphasic system，the production yield obtained by Ca2+/SBA-15 immobilized enzyme was increased by 23.8%.

fusion enzyme ; SBA-15; immobilization; biphasic system; bioreduction

Q 814.2

：A

：1000-6613（2015）11-4047-07

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.11.036

2015-03-06；修改稿日期：2015-04-08。

王爽（1989—），女，碩士研究生。聯系人：聶堯，教授，主要研究方向為生物催化。E-mail nieybird@hotmail.com。