鈣激活中性蛋白酶-2對整合素β4水解的影響*

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鈣激活中性蛋白酶-2對整合素β4水解的影響*

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1906.020.html

胡曉霞1, 霍建云1， 張金娟2， 潘婭1， 王晉星一1， 陳妮1， 張祥令3， 陳騰祥1**

(1.貴陽醫(yī)學院 生理學教研室, 貴州 貴陽550004； 2.貴陽醫(yī)學院 機能學實驗室, 貴州 貴陽550004; 3.貴陽醫(yī)學院 組織胚胎學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察乳腺癌細胞系MCF7細胞中，鈣激活中性蛋白酶2(calpain-2)對整合素(integrin)β4水解的影響。方法: 利用“短發(fā)夾”RNA(shRNA)和微小RNA(mirRNA)技術結合的calpain-2基因沉默(gene silencing)慢病毒質粒(GIPZ lentiviral shRNAmir)轉染乳腺癌細胞株MCF7，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定沉默calpain-2基因的細胞株，細胞株傳4代，用熒光顯微鏡觀察轉染效率，用蛋白質印跡(Western blot)實驗檢測calpain-2基因沉默效率及integrin β4水解的情況。結果: 嘌呤霉素篩選、細胞傳4代，熒光顯微鏡下觀察顯示轉染和篩選后，EGFP表達陽性的MCF7細胞的比例分別達到(95.6±2.6)%(空shRNAmir 載體)、(97.1±1.7)%(Calpain-2 shRNAmir 1)和(97.7±0.2)%(Calpain-2 shRNAmir 2)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Western blot結果顯示，基因沉默的MCF7細胞中calpain-2的表達被明顯抑制，相對于空shRNAmir 載體轉染的MCF7細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，calpain-2的表達下調到21.5%(Calpain-2 shRNAmir 1)和18.8%(Calpain-2 shRNAmir 2)，空shRNAmir 載體轉染的MCF7細胞中calpain-2的表達與未轉染的MCF7細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；比較calpain-2基因沉默和空shRNAmir載體轉染的MCF7細胞，發(fā)現(xiàn)integrin β4均被水解，水解片段的分子量主要有200 kD、130和95 kD；calpain-2基因沉默后，calpain-2基因沉默MCF7細胞中200 kD的水解片段比空shRNAmir載體轉染的MCF7細胞減少(P<0.01)。結論: 在乳腺癌細胞MCF7中，calpain-2可能參與integrin β4的200 kD片段的形成，從而參與調整integrin β4的構象變化。

[關鍵詞]乳腺腫瘤； 鈣激活中性蛋白酶 2； 整合素β4; 蛋白水解； 基因沉默

Research on the Effect of Calpain-2 on the Proteolysis

整合素(integrin)β4是整合素亞家族成員之一，整合素屬細胞表面的黏附分子，構成細胞與細胞外基質及細胞之間的聯(lián)系。在上皮細胞膜表面，integrin β4與另外1個亞家族成員integrin α5形成二聚體，作為一個功能單元與網(wǎng)格蛋白(plectin)、大天皰瘡抗原2(bullous pemphigoid antigen 2，BPAG2)以及大天皰瘡抗原1e(BPAG1e)構成半橋粒(hemidesmosomes)，半橋粒與細胞外基質中的laminin 5結合，使細胞錨定在基質膜(basement membrane)上[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，當細胞膜上的半橋粒被解體，細胞就會與基質膜解離，失去錨定，而且通過信號轉導，導致細胞間的連接解體，使細胞游離出來，成為可以轉移的細胞[2]。在這些過程中，integrin β4扮演著重要的角色，integrin β4胞內Ser1424位點的磷酸化是調控半橋粒的解體的重要步驟，而蛋白質相應位點的磷酸化通常需要蛋白質發(fā)生構象的改變。蛋白質剪切修飾是改變蛋白質構象和功能的主要方式之一[3]。有研究報道integrin家族成員可以被水解成小片段，而鈣激活中性蛋白酶(calpain)是integrin的水解酶之一[4-5]。目前尚未清楚calpain對integrinβ4的水解形式。本課題擬通過基因沉默下調calpain-2在MCF7細胞中的表達，檢測integrinβ4被水解的情況，從而了解calpain-2對integrinβ4的水解影響。

1材料與方法

1.1藥物和試劑

“短發(fā)夾”RNA(short hairpin RNA，shRNA)mir慢病毒(lentiviral)質粒和菌株購于美國Open Biosystems公司，calpain-2 large subunit (M-type) antibody、integrin β4 antibody購于美國cell signaling technology公司，DMEM、胎牛血清(FBS)購于美國invitrogen公司，聚丙烯酰胺、雙甲叉丙烯酰胺購于美國sigma-aldrich公司，其它試劑均為進口或國產分析純。

1.2主要儀器及設備

電泳儀及微型垂直電泳槽購于美國GE公司， GBOX iChemiXR化學發(fā)光及凝膠成像儀購于美國Syngene公司，倒置熒光顯微鏡購于奧林巴斯公司，高速冷凍離心機購于美國Beckman公司。

1.3細胞培養(yǎng)及基因沉默

MCF7細胞株購買于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，于DMEM培養(yǎng)液、37 ℃、10%FBS和5% CO2培養(yǎng)。分別用shRNAmir lentiviral空載體GIPZ質粒(vecter)、含calpain-2基因(GenBank登錄號NM-001748)沉默核酸片段(Calpain-2 shRNA1為CCC TTG GCA GGG AAT ATT T，Calpain-2 shRNA2為GCC AAG ATA TCA AGT CAG A為美國Open Biosystems公司設計合成)的GIPZ lentiviral轉染MCF7細胞，用2 mg/L嘌呤霉素進行逐代篩選，于熒光顯微鏡下和激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察報告基因增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的表達情況。用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0進行細胞計數(shù)分析，每個轉染細胞的培養(yǎng)皿中觀察6個視野，計算細胞數(shù)的均數(shù)及shRNAmir lentiviral質粒轉染效率。

1.4calpain-2基因沉默效率及integrin β4水解的情況

采用Western blot方法檢測calpain-2基因沉默效率及integrin β4水解的情況。將細胞鋪6 cm培養(yǎng)皿，擴大培養(yǎng)至80%的細胞滿度，洗滌后加入預冷RIPA細胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，1% NP40，0.5% Na Deoxycholate， 0.1% SDS，10% glycerol，137 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na Vanadate，1 mmol/L PMSF)，冰上裂解10 min，刮取裂解物，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，上樣行SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜，室溫封閉1 h，4 ℃ I抗孵育過夜，室溫II抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化學發(fā)光試劑，GBOX iChemiXR進行化學發(fā)光檢測。用圖像分析軟件對目的蛋白進行灰度定量，除于內參灰度，計算相對灰度值(relative gray scale)。每組Western blot實驗重復3次。

1.5統(tǒng)計學方法

利用SPSS 16.0對細胞數(shù)均值、Western blot蛋白質條帶相對灰度值均數(shù)進行t檢驗。P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1shRNAmir lentiviral質粒轉染效率

通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，shRNAmir lentiviral空載體GIPZ質粒(vecter)、含calpain-2基因沉默shRNAmir片段的GIPZ lentiviral質粒(calpain-2 shRNAmir1、calpain-2 shRNAmir2)轉染的MCF7細胞均有報告基因EGFP表達(圖1A)。利用嘌呤霉素進行篩選，未含質粒抗性基因的細胞逐漸凋亡，表達質粒基因或shRNAmir片段的細胞比例增加，篩選到第4代后，EGFP表達陽性的MCF7細胞的比例分別達到(95.6±2.6)%(空shRNAmir 載體)、(97.1±1.7)%(Calpain-2 shRNAmir 1)和(97.7±0.2)%(Calpain-2 shRNAmir 2)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1B),表明空載體質粒和含基因沉默片段的質粒的細胞轉染效率沒有差異。2.2calpain-2 shRNAmir 對MCF7細胞calpain-2的基因沉默效果

注：A圖為質粒轉染細胞后48 h EGFP的表達，BF為激光共聚焦顯微鏡明場視野下的觀察，Merge為相應的EGFP和BF觀察圖的疊加；B圖為嘌呤霉素篩選后表達EGFP的細胞數(shù)，P1、P2、P3和P4分別為篩選細胞的傳代數(shù)圖1　shRNAmir GIPZ lentiviral質粒轉染MCF7后篩選的效果Fig.1　The effect of transfection by shRNAmir GIPZ lentiviral plasmid after puromycin screening

(1)與未轉染與空shRNAmir載體MCF7比較，P<0.01圖2　MCF-7細胞中Calpain-2的表達(Western blot)Fig.2　The expression of calpain-2 in the stably transfected MCF-7 cells

通過Western blot實驗檢測發(fā)現(xiàn)，基因沉默的MCF7細胞中calpain-2的表達被明顯抑制，相對于空shRNAmir 載體轉染的MCF7細胞，calpain-2的表達下調至21.5%(Calpain-2 shRNAmir 1)和18.8%(Calpain-2 shRNAmir 2)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，空shRNAmir 載體轉染的MCF7細胞中calpain-2的表達與未轉染的MCF7細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。2.3calpain-2基因沉默MCF7細胞中integrin β4的水解模式

如圖3，MCF7細胞中integrin β4未被水解的原始片段大小約為210 kD，被水解的小分子片段，主要片段的分子量大小約為200、130和95 kD。calpain-2基因沉默MCF7細胞中200 kD的水解片段比空shRNAmir載體轉染的MCF7細胞減少(P<0.01)。

圖3　MCF-7細胞中integrin β4的水解模式(Western blot)Fig.3　The effect of calpain-2 gene silence on the proteolysis of integrin β4 in MCF7 cell

3討論

基因沉默是指基因在轉錄和翻譯時受到阻礙，導致表達下調和缺失，從而喪失其蛋白質所執(zhí)行的功能。在實驗室中，通過非編碼RNA分子(non-coding RNA)的干擾(RNA interference，RNAi)來沉默基因是目前的主要手段。在非編碼RNA中，微小RNA(microRNA, miRNA)是最主要的干擾片段。miRNA含有18~25個氨基酸，根據(jù)堿基互補配對原則與靶mRNA結合形成沉默復合物，影響mRNA的穩(wěn)定性或阻遏mRNA的翻譯。內源性的miRNA的前體是含莖環(huán)結構的shRNA，在Dicer酶的降解作用下，產生miRNA。本研究采用的基因沉默技術方法稱為shRNAmir技術，設計的RNA片段含有shRNA，在兩側還分別有miRNA片段，這些片段重組構建在lentiviral載體上，可以轉染或感染細胞后，可以在細胞內降解產生數(shù)量較多的miRNA，比較高效地沉默靶mRNA[6]。在本研究中，針對calpain-2設計的shRNAmir lentiviral載體及未含靶基因shRNAmir的空載體對細胞的轉染效率是相同的，但是針對靶基因calpain-2的2個shRNAmir(Calpain-2 shRNAmir 1和Calpain-2 shRNAmir 2)具有很好的基因沉默效率，使MCF7細胞的calpain-2的表達下調了80%。

Calpain是由鈣離子激活的中性蛋白酶，最常見的有calpain-1和calpian-2，calpain-1可被微摩爾級濃度的鈣離子激活，而calpain-2則需要毫摩爾級濃度的鈣離子才能激活[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，calpain-2的基因沉默引起integrin β4 的降解模式發(fā)生了改變。在乳腺癌細胞MCF7中，完整的integrin β4的分子量為210 kD。本研究檢測發(fā)現(xiàn)integrin β4有水解片段，水解片段的分子量大小約為200、130和95 kD， calpain-2的基因沉默后，integrin β4的200 kD水解片段明顯減少，表明integrin β4有限水解成為200 kD的蛋白分子與calpain-2有關。Integrin可以被一些蛋白酶水解修飾，從而導致結構的改變。有研究發(fā)現(xiàn)，integrin β4可以被多種水解酶降解，其中基質金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinases 9, MMP9) 可以水解integrin calpain-2的細胞外段，使得胞漿中產生大約100 kD的片段，使得半橋粒解體，使細胞與基質脫離[8]。Werner ME[9]發(fā)現(xiàn)caspase-3和caspase-7 則可以對integrin β4的胞內段進行水解，導致半橋粒不能組裝，誘使上皮細胞凋亡；Potts AJ[4]發(fā)現(xiàn)，calpain可以將integrin β4水解為205、165和125 kD的片段；Giancotti FG[5]發(fā)現(xiàn)calpain可以將integrin β4水解為165 和130 kD的片段。但是，這些實驗還未解析calpain-2在其中所扮演的角色，在腫瘤細胞中，鈣離子的波動較大，使得calpain-2在腫瘤細胞的活動中扮演了重要的角色[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，calpain-2可以促進癌細胞的浸潤[7]。因此，搞清楚calpain-2對integrin β4的水解作用，有利于理解期對半橋粒的影響和腫瘤的浸潤能力的作用機制。本研究表明，calpain-2可能參與integrin β4的200 kD片段的形成，從而參與調整integrin β4的構象變化。

參考文獻4

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(2014-12-08收稿，2014-12-28修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

·專題研究·

of Integrin β4 in MCF7 Cell

HU Xiaoxia1, HE Jianyun1， ZHANG Jinjuan2, PAN Ya1, WANG Jingxingyi1,

CHEN Ni1, ZHANG Xiangling3, CHEN Tengxiang1

(1.DepartmentofPhysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.FunctionalLaboratory,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofHistologyandEmbryology,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the effect of calcium-activated neutral proteases 2(calpain-2) on proteolysis of integrin β4 in breast cancer cell line, MCF7. Methods: Plasmids of GIPZ lentiviral shRNAmir combined with shRNA and microRNA (miRNA) technology were transfected into MCF7 cells to silence the expression of calpain-2. The puromycin was used to screen MCF7 with 4 passages to acquire the stable calpain-2-silenced cell lines. The transfected rates were evaluated with immunofluorecence method under microscope, and efficiency of calpain-2 silencing and integrin β4 proteolysis condition were detected with Western blot. Results: As immunofluorescence microscope result showing, the ratios of the cells expressing green fluorescence protein (GFP) were (95.6±2.6)%(empty shRNAmir), (97.1±1.7)%(calpain-2 shRNAmir 1)and(97.7±0.2)%(calpain-2 shRNAmir 2), without statistic diversity (P>0.05) . The expression of calpain-2 had no distinctive diversity (P>0.05) in empty shRNAmir transfected MCF7 cells and in control, while was decreased to 21.5%, 18.8% in calpain-2 shRNAmir 1 and 2 transfected cells respectively V.S. control (P<0.01). In MCF7 cell, integrin β4 were cut into low molecular weight (LMW) fragment as 200 kD, 130 kD and 95 kD. However, in calpain-2 silenced MCF7 cell, 200 kD fragments were decreased. Conclusion: Formation of 200 kD fragments of integrin β4 is associated with calpain-2.

[Key words]breast neoplasms; calcium-activated neutral proteases 2; integrein β4； proteolysis; gene silencing

[中圖分類號]R737.9； R73-37

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0001-05

通信作者**E-mail:gzctxin@qq.com網(wǎng)絡出版時間：2015-01-13

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(NO. 81060176)；貴州省科技廳自然 [黔科合J字(2008)2280]；貴陽市科技局社會發(fā)展公關計劃項目[筑科農字(2010)1號]