雌二醇對三陰乳腺癌細胞integrin β4水解作用的影響*

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雌二醇對三陰乳腺癌細胞integrin β4水解作用的影響*

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1901.018.html

陳騰祥1， 嚴莉莎1, 霍建云1， 張金娟2， 潘婭1， 王晉星一1， 陳妮1， 臧貴勇3， 胡曉霞1

(1.貴陽醫學院 生理學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽醫學院 機能學實驗室， 貴州 貴陽550004； 3.貴陽醫學院 人體解剖學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究三陰乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231細胞中雌二醇對整合素(integrin)β4水解的促進作用。方法: 常規培養MDA-MB-231細胞至指數增長期，分別給予17β-雌二醇、雌激素受體(ER)特異性阻斷劑4-羥基他莫西芬(OHT)和G蛋白偶聯受體30(GPR30)特異性阻斷劑G-15干預30 min，采用蛋白質印跡(Western blot)實驗檢測鈣激活中性蛋白酶 2(calpain 2)的表達和integrin β4水解的情況。 結果: 17β-estradiol在短時間內可促進MDA-MB-231細胞130 和95kD integrin β4水解片段的產生，促進作用呈濃度依賴方式，而對calpain 2表達沒有明顯影響；4-OHT不能阻斷17β-estradiol對integrin β4的水解作用，且其本身可促進integrin β4水解；G-15能阻斷17β-estradiol對integrin β4的水解。結論: 在TNBC MDA-MB-231細胞中，17β-estradiol可通過GPR30促進130和95kDintegrin β4水解片段的產生。

[關鍵詞]三陰乳腺癌； 整合素β4; 鈣激活中性蛋白酶 2； 17β-雌二醇； 4-羥基他莫西芬； G蛋白偶聯受體30

The Proteolysis of Integrin β4 in Triple Negative Breast

整合素(integrin)β4與另外1個亞家族成員integrin α5形成二聚體，是構成半橋粒的重要組成部分，可使細胞錨定在基質膜上[1]。integrin β4不僅有黏附功能，也參與細胞信號轉導[2]。研究發現，integrin β4可以被鈣激活中性蛋白酶2(calpain 2)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)等蛋白酶水解，不同蛋白酶對其水解所產生的細胞行為變化不同[3-4]。本研究發現，在雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性的三陰乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)MDA-MB-231細胞中，17β-雌二醇 (17β-estradiol)可以促進integrin β4的水解，本課題對其可能機制進行研究。

1材料與方法

1.1試劑與設備

calpain-2 large subunit (M-type) antibody、integrin β4 antibody購于美國cell signaling technology公司，DMEM、胎牛血清(FBS)購于美國invitrogen公司，4-羥基他莫西芬(4-hydroxytamoxifen，OHT)、17β-estradiol、聚丙烯酰胺以及雙甲叉丙烯酰胺購于美國sigma-aldrich公司，G蛋白偶聯受體30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)特異性阻斷劑G-15購于英國Tocris Bioscience公司，其它試劑均為進口或國產分析純。電泳儀及微型垂直電泳槽購于美國GE公司， GBOX iChemiXR化學發光及凝膠成像儀購于美國Syngene公司，倒置熒光顯微鏡購于奧林巴斯公司，高速冷凍離心機購于美國Beckman公司。

1.2MDA-MB-231細胞的培養

MDA-MB-231細胞株購買于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，于DMEM(高糖)培養液、37 ℃、10%FBS和5% CO2培養。

1.3實驗方法

為了了解17β-estradiol是否可以促進MDA-MB-231乳腺癌細胞integrin β4的水解，實驗用17β-estradiol處理MDA-MB-231乳腺癌細胞；為了解17β-estradiol是否是通過ER促進MDA-MB-231細胞integrin β4的水解，實驗采用了ER的特異性阻斷劑4-OHT進行干預；為了解17β-estradiol是否是通過GPR30促進MDA-MB-231細胞integrin β4的水解，實驗采用GPR30特異性阻斷劑G-15進行干預；上述實驗干預時間為30 min。Western blot檢測步驟如下：將MDA-MB-231細胞鋪于6 cm培養皿，培養至指數增長期；用37℃ PBS快速洗滌后，加入預冷RIPA細胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl、 pH 7.5，1% NP40，0.5% Na Deoxycholate， 0.1% SDS，10% glycerol，137 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na Vanadate，1 mmol/L PMSF)，冰上裂解10 min，刮取裂解物，4℃ 12 000 r/min離心30 min，上樣行SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜，室溫封閉1 h，4 ℃ I抗孵育過夜，室溫II抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化學發光試劑，GBOX iChemiXR進行化學發光檢測。每組Western blot實驗重復3次。

2結果

2.117β-estradiol促進MDA-MB-231乳腺癌細胞integrin β4水解

17β-estradiol可以促進130和95 kD integrin β4水解片段產生，這種促進作用呈濃度依賴方式，在10-7 mol/L的濃度時，剪切作用最為明顯；17β-estradiol沒有使calpain 2的表達發生明顯改變。見圖1。

2.2ER阻斷劑4-OHT不能阻斷17β-estradiol對integrin β4的水解

OHT不能阻斷17β-estradiol對integrin β4的水解，而且OHT單獨作用30 min也可以促進130和95 kD integrin β4水解片段產生。17β-estradiol和OHT同時作用時，促進integrin β4水解的效應沒有明顯的疊加。見圖2。

2.3GPR30阻斷劑G15可阻斷17β-estradiol對integrin β4的水解

G-15可阻斷17β-estradiol對integrin β4的水解，G-15單獨作用不能促進integrin β4的水解。見圖3。

圖2　ER阻斷劑4-OHT對MDA-MB-231乳腺癌細胞integrin β4水解的影響Fig.2　The role of estrogen receptor (ER) blocker in the proteolysis of integrin β4 in MDA-MB-231 breast cancer cells

圖3　G15對 MDA-MB-231細胞integrin β4水解的影響Fig.3　The role of GPR30 blocker in the proteolysis of integrin β4 in MDA-MB-231 breast cancer cells

3討論

ER、妊激素受體(progesterone receptor，PR)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)等3種受體陰性的乳腺癌細胞稱為三陰乳腺癌(TNBC)。此型乳腺癌好發于年輕女性，腫瘤的侵襲力強，易發生轉移，預后效果差，5年生存率不到5%[5]。由于ER、PR和HER2為陰性，所以針對這3種受體的阻斷治療無效，臨床還缺乏相應的治療指南，因此成為乳腺癌研究的難點和重點。MDA-MB-231屬于三陰乳腺癌細胞，是研究三陰乳腺癌的重要工具細胞。本實驗對MDA-MB-231細胞integrin β4的表達進行檢測，發現其表達為陽性，而且在未受到其它因素干預的情況下，integrin β4的水解不明顯。本實驗給予雌激素(17β-estradiol)短時間處理，integrin β4的130 和95kD的水解片段明顯增多。常見的integrin β4水解片段的分子量大小有200、130和95 kD。本課題組在ER和PR陽性的乳腺癌細胞中發現，200 kD的 integrin β4水解片段的產生與calpain 2的水解作用有關[6]；有研究報道，分子量大小約為95 kD的水解片段的產生可能與基質金屬蛋白酶(MMP)有關[3]。這些結果和數據提示，17β-estradiol可能通過影響MMP和其它的水解酶導致MDA-MB-231細胞integrin β4的水解增加，而calpain 2可能不參與其中的作用。MDA-MB-231中ER陰性，因此17β-estradiol不太可能通過ER發揮作用，本實驗采用ER受體阻斷劑4-hydroxytamoxifen進行干預，結果發現4-hydroxytamoxifen不但不能阻斷17β-estradiol促integrin β4水解的作用，其自身單獨作用也可以促進integrin β4的水解。研究報道，雌激素的受體除了ERα和ERβ以外，還有GPR30，GPR30與ERα和ERβ沒有同源型，主要定位于細胞質膜上，在MDA-MB-231細胞中，GPR30定位于內質網[7]。在ERα和ERβ陰性的組織細胞中，雌激素可通過GPR30發揮生物效應。4-hydroxytamoxifen對于ERα和ERβ是阻斷劑，而對于GPR30則是激動劑。這些提示，17β-estradiol和4-hydroxytamoxifen都是通過GPR30促進integrin β4的水解。為了進一步確認，本實驗采用GPR30特異性抑制劑G-15[8]進行干預，結果發現G-15能有效地阻斷17β-estradiol對MDA-MB-231細胞integrin β4的水解促進作用，表明17β-estradiol是通過GPR30促進integrin β4的130 kD和95kD的水解片段產生，進而影響乳腺癌細胞的生物學行為。

參考文獻4

[1] Dellambra E, Prislei S, Salvati AL, et al. Gene correction of integrin beta4-dependent pyloric atresia-junctional epidermolysis bullosa keratinocytes establishes a role for beta4 tyrosines 1422 and 1440 in hemidesmosome assembly[J]. J Biol Chem, 2001(44):41336-41342.

[2] Guo W, Pylayeva Y, Pepe A, et al. Beta 4 integrin amplifies ErbB2 signaling to promote mammary tumorigenesis[J]. Cell, 2006(3):489-502.

[3] Pal-Ghosh S, Blanco T, Tadvalkar G, et al. MMP9 cleavage of the beta4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice[J]. J Cell Sci, 2011(Pt 15):2666-2675.

[4] Werner ME, Chen F, Moyano JV, et al. Caspase proteolysis of the integrin beta4 subunit disrupts hemidesmosome assembly, promotes apoptosis, and inhibits cell migration[J].J Biol Chem, 2007(8):5560-5569.

[5] Poteca T, Comanescu M, Poteca A, et al. The many faces of triple negative breast cancer[J]. Chirurgia, 2014(4):471-479.

[6] 胡曉霞, 霍建云, 張金娟, 等. 鈣激活中性蛋白酶-2對整合素β4水解的影響[J].貴陽醫學院學報, 2015(1): 1-5.

[7] 羅浩軍, 楊光倫, 涂剛雌. 激素受體GPR30研究進展[J].中國癌癥雜志, 2009(11):881-886.

[8] Dennis MK, Burai R, Ramesh C, et al. In vivo effects of a GPR30 antagonist[J]. Nature Chemical Biology, 2009(6):421-427.

(2014-12-01收稿，2014-12-25修回)

Cancer Cell is Enhanced by Estradiol via GPR30

CHEN Tengxiang1, YAN Lisha1, HE Jianyun1，ZHANG Jinjuan2, PAN Ya1,

WANG Jingxingyi1, CHEN Ni1, ZANG Guiyang3, HU Xiaoxia1

(1.DepartmentofPhysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Functional

Laboratory,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofAnatomy,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the way of estrogen to enhance the proteolysis of integrin β4 in triple negative breast cancer (TNBC) cell, MDA-MB-231. Methods: MDA-MB-231 was treated with 17β-estradiol , 4-hydroxytamoxifen(OHT) and G-15 for 30 min respectively or jointly when the cell reached to exponential growth stage. Then, Western blot was used to detect the proteolysis of integrin β4 and the expression of calpain 2. Results: As Western blot results showing, not the expression of calpain 2, but the hydrolysis products of integrin β4 with molecular weight of 130 kD and 95kD were raised by 17β-estradiol in a short time with dose-dependent way. However, an estrogen receptor (ER) specific inhibitor could enhance, instead of block, the proteolysis function of 17β-estradiol to integrin β4, which could be blocked by the specific inhibitor of G-coupled protein receptor (GPR) 30, G-15. Conclusion: In TNBC cell, MDA-MB-231, the hydrolysis products of integrin β4 with 130 and 95 kD are enhanced by 17β-estradiol via GPR30.

[Key words]triple negative breast cancer; integrein β4；calcium-activated neutral proteases 2; 17β-estradiol; 4-hydroxytamoxifen; G-coupled protein receptor 30

[中圖分類號]R737.9； R73-37

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0010-03

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(NO. 81060176);貴陽醫學院院基金(院基金合同字第2012005號);貴州省高層次人才科研條件特助經費(TZJF-2009年38號)網絡出版時間：2015-01-13