貴陽地區250例哮喘患兒IL-4基因-590C/T的多態性與血漿IgE水平的相關性*

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貴陽地區250例哮喘患兒IL-4基因-590C/T的多態性與血漿IgE水平的相關性*

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1911.022.html

曾艷1， 鄧勝藍1， 李波1， 楊俊1， 崔玉霞2， 盧根3， 朱曉萍1**

(1.貴陽醫學院 兒科學教研室, 貴州 貴陽550004； 2.貴州省人民醫院， 貴州 貴陽550004； 3.貴陽市兒童醫院， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討白細胞介素-4(IL-4)基因啟動子區-590C/T位點與貴陽地區兒童支氣管哮喘的相關性及不同基因型對患兒血漿總IgE(TIgE)水平的影響。方法： 用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法,檢測貴陽地區250例哮喘患兒(哮喘組)及200例健康對照兒童(對照組)IL-4基因-590C/T位點的多態性,分析IL-4基因-590C/T位點基因型頻率分布，以及與哮喘危險性的關系；采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測兩組血漿TIgE水平，比較lL-4-590C/T位點不同基因型間血漿TIgE水平。結果： IL-4基因-590C/T位點在哮喘組和對照組中存在CC、CT、TT 3種基因型，且基因型頻率在組間的分布差異有統計學意義(χ2=13.395，P<0.01)；哮喘組和對照組IL-4基因-590C/T位點C等位基因頻率與T等位基因頻率的差異有統計學意義(χ2=16.384，P<0.01)，此位點變異基因型TT攜帶者患病危險性均高于CC純合子或CT雜合子基因型攜帶者(OR=1.78，95%CI=1.22~2.60)，且T變異等位基因攜帶者患病危險均高于非攜帶者(χ2=9.851， P<0.01；OR= 1.82，95%CI=1.36~2.44)；相同基因型血漿TIgE水平哮喘組高于對照組(P<0.05)，哮喘組變異基因T攜帶者TIgE水平明顯高于非攜帶者(t=1.978，P<0.05)，對照組變異基因T攜帶者與非攜帶者TIgE水平比較，差異無統計學意義(t=0.249， P>0.05)。結論： IL-4基因-590C/T位點T等位基因與哮喘發病相關，且變異基因T與血漿TIgE水平升高相關。

[關鍵詞]兒童； 支氣管哮喘； 白細胞介素-4； 多態性，單核苷酸； 免疫球蛋白E

支氣管哮喘(bronchial asthma)簡稱哮喘,是一種氣道慢性炎癥性疾病，其實質是氣道嗜酸性粒細胞、肥大細胞的浸潤。Th細胞在過敏性哮喘中發揮著重要的免疫調節作用，Th2占優勢的Th1/Th2失衡是過敏性哮喘發病的一個重要機制，Th2類細胞因子增加，導致IgE合成增加，直接或間接誘導肥大細胞、嗜酸性粒細胞脫顆粒產生氣道高反應及炎癥。近年來白細胞介素-4(IL-4)基因啟動子區多態性已成為國內外許多學者的研究熱點，但研究結果不盡相同，可能是研究對象人群、種族和地域的差異造成。為了進一步明確IL-4基因多態性與貴陽地區兒童哮喘的相關性、及這個位點與血漿TIgE水平的相關性，本研究檢測IL-4-590C/T多態性位點的基因型頻率、等位基因頻率及血漿TIgE水平。

1材料與方法

1.1對象與分組

哮喘組來源于2010年8月~2012年1月兒科哮喘門診隨機診治的哮喘兒童及第三次全國哮喘流行病學調查的哮喘兒童共250例，其中男160例，女90例，平均(6.60±3.40)歲，入選對象均符合《支氣管哮喘防治指南》診斷標準[1]。對照組來源于2010年8月~2011年2月門診體檢的健康兒童共200例，其中男136例，女64例，平均(4.91±3.73)歲，排除哮喘病史、典型過敏性疾病(過敏性鼻炎、結膜炎、濕疹等)、一二級親屬哮喘及過敏性疾病家族史。全部研究對象均無血緣關系且均為貴陽地區兒童。

1.2方法

1.2.1標本采集及DNA提取空腹抽取外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝，用DNA提取試劑盒(離心柱型)DP318分離提取DNA，核酸蛋白分析儀檢測DNA純度及濃度。

1.2.2IL-4基因-590C/T位點的引物設計合成及PCR擴增參照GenBank中人IL-4DNA序列(編號NC 000005.9)，根據rs.2243250在美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站上查詢到包括-590C/T位點的基因序列，確定突變位點，利用Primer Premier5.0軟件設計引物，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術分析。PCR反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl 21.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，10 μmol/L引物(TaKaRa公司)各 1.0 μL，90 mg/L模板DNA 2.5 μL，5 U/μL Taq DNA連接酶(TaKaRa公司)0.2 μL，用雙蒸水補足25 μL總反應體系。引物序列及PCR反應條件見表1，反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳后G:BOX凝膠成像系統拍照鑒定。

表1　IL-4-590C/T基因多態性引物

1.2.3IL-4基因-590C/T位點的RFLP檢測IL-4基因PCR產物的限制性內切酶為AvaII，酶切體系： 8 μL PCR產物，10×Buffer R 1 μL ,10 U/μL AvaII內切酶(Fermentas)1 μL，用雙蒸水補足20 μL，于37 ℃恒溫水溫箱中消化2 h，終止酶切反應后，2%瓊脂糖凝膠電泳及G:BOX凝膠成像系統拍照分析基因型。分析兩組兒童的基因型頻率分布是否具有群體代表性，比較兩組兒童的基因型頻率分布，并評估各基因型與哮喘的相關性。

1.2.4血漿總IgE(TIgE)檢測采用酶聯免疫吸附法(ELISA )技術，按照試劑盒操作步驟測定外周血TIgE水平。

1.3統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。對哮喘組與對照組之間基因型頻率分布行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗，研究資料是否具有群體代表性；兩組基因型頻率、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗；計算優勢比(odds ratios，ORs)與95%可信區間(95% confidence intervals，CIs)評估各基因型與哮喘的相關性；同組間不同基因型TIgE比較采用方差分析，不同基因型間TIgE兩兩比較采用LSD檢驗，兩組間TIgE比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2結果

2.1IL-4基因-590C/T位點的多態性

哮喘組和對照組IL-4基因-590C/T位點PCR擴增產物均為195 bp，如圖1；該產物經對應限制性核酸內切酶酶切后發現CC、CT、TT 3種基因型，如圖2。

注:M為DL500Marker，1、2為哮喘組，3、4為對照組，5為陰性對照，6為陽性對照圖1　哮喘組和對照組IL-4基因-590C/T位點PCR擴增產物(2%瓊脂糖電泳)Fig.1　Electrophoresis of PCR products of the -590 C/T site of IL-4 gene

注：M為DL500Marker，1、2、3為TT基因型(195 bp)，4為CC基因型(177 bp、18 bp，18 bp片段已出膠)，5為CT基因型(195 bp、177 bp、18 bp，18 bp片段已出膠)，6為陽性對照，7為陰性對照 圖2　IL-4基因-590C/T 位點不同基因型PCR產物酶切電泳結果Fig.2　Enzyme digestion electrophoresis of PCR products of different genotypes of IL-4 gene -590 C/T site

2.2IL-4基因-590C/T位點基因型頻率分布與哮喘危險性的關系

哮喘組和對照組在IL-4 基因-590C/T位點均檢出C、T兩種等位基因，基因型期望值和觀察值之間無統計學意義(χ2=4.883和4.243，P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡，基因頻率達到遺傳平衡，具有群體代表性。哮喘組與對照組基因型頻率分布差異有統計學意義[總χ2=13.395，χ2(0.01,2)=9.210，P<0.01]。不同基因型患兒哮喘的危險性不一樣，χ2分割檢驗顯示，CC基因型與CT+TT基因型比較差異有統計學意義(χ2=9.851，P<0.01)，但CT基因型與TT基因型比較差異無統計學意義(χ2=3.039，P>0.05)；攜帶TT純合子基因型者患哮喘的危險性高于CC純合子或CT雜合子基因型患兒(OR=1.78，95%CI1.22~2.60)。兩組等位基因頻率分布比較，變異等位基因T與哮喘關聯(χ2=16.384，P<0.01)，變異等位基因T攜帶者患哮喘的危險性較非攜帶者高，OR(T/C) =1.82，95%CI1.36~2.44，見表2。

表2　哮喘患兒lL-4-590C/T位點基因型及等位基因分布頻率

2.3lL4-590C/T位點不同基因型被檢者血漿TIgE水平

哮喘組平均TIgE水平(277.96±260.87) IU/mL，對照組平均TIgE水平(56.15±45.42)IU/mL，兩組之間差異有統計學意義(t=11.879，P<0.05)。哮喘組3種基因型TIgE水平差異有統計學意義(F=7.273，P<0.05)，對照組3種基因型TIgE水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。變異等位基因T攜帶者(CT基因型+TT基因型)和非攜帶者(CC基因型)血漿TIgE水平比較，哮喘組攜帶T等位基因的哮喘患兒血漿TIgE濃度顯著高于非攜帶患兒，差異有統計學意義(t=1.978，P<0.05)，而對照組差異無統計學意義(t=0.249，P>0.05)。見表4。

表3　IL-4基因-590C/T位點不同基因型被檢者血漿TIgE水平

表4　IL-4基因-590C/T位點變異等位基因T攜帶與

3討論

哮喘是多種細胞和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病，這種慢性炎癥導致氣道反應性增加，是兒童最常見的呼吸系統變態反應性疾病[2]。哮喘病因繁多，發病機制至今尚不十分清楚。多年來運用定位克隆、全基因組掃描、候選基因技術等方法，確認哮喘是一種復雜的多基因遺傳性疾病，具有遺傳易感性，多個基因和環境因子控制其發生發展[3-4]。研究發現人染色體5q31-33與哮喘密切相關，哮喘候選基因IL-4正位于此區域[5]。IL-4基因多態性與其他多個哮喘易感基因之間交互作用共同影響哮喘的發病風險和表型[6]，由于各種炎癥介質對氣道的作用不同，它們之間的相互作用促使氣道高反應性和氣道炎癥的產生和加重，最終引起血清TIgE水平升高，從而形成哮喘的病理生理學特征。IgE 作為氣道過敏性炎癥的關鍵觸發因素的概念已被廣泛接受，是診斷哮喘及氣道高反應性的一項重要參考指標。

Rosenwasser等[7]人首次發現IL-4基因啟動子區距轉錄起始密碼子ATG上游第590 bp位點(也有人認為是上游-589 bp位點)是個多態性位點，存在著C到T的突變，且在白種人中該位點的變異等位基因T與哮喘兒童體內外高IgE或高IL-4水平的表達密切相關。Sandford等[8]研究還發現，IL-4基因-590C/T位點變異等位基因頻率在重度哮喘患者中明顯高于中度和非哮喘患者，提示IL-4基因-590C/T位點與哮喘的發病及哮喘嚴重程度有關。S Micheal等[9]報道在巴基斯坦人群中，IL-4基因-589C/T位點變異基因T與哮喘及過敏性鼻炎均有相關性。我國黃花榮等[10]研究顯示IL-4基因-589C/T位點基因型和等位基因頻率分布在哮喘組和對照組均有顯著差異，T等位基因是哮喘的易感基因。但張嘉琳等[11]對哮喘兒童IL-4基因-590C/T位點的多態性及IL-4產生水平的研究中，未發現IL-4基因-590C/T位點與哮喘的發病及臨床表型有明顯的相關關系。

本研究發現哮喘組與對照組中IL-4-590C/T位點共有3種基因型，分別為野生型(CC)、雜合子(CT)及突變型(TT)；哮喘組與對照組基因型和等位基因頻率分布有明顯差異，而且不同的基因型患哮喘的危險性不一樣，TT純合子基因型攜帶者患哮喘的危險性高于CT雜合子和CC純合子基因型攜帶者；變異等位基因T攜帶者患哮喘危險性高于非攜帶者；等位基因T與哮喘關聯；表明貴陽地區兒童中當-590C/T位點C轉為T時患哮喘的危險高于正常兒童。這與sandford等[8]研究結果相一致，提示IL-4基因-590C/T位點變異，等位基因T攜帶者更容易罹患哮喘。

本研究中，哮喘患兒血漿TIgE濃度明顯高于正常兒童，血漿TIgE水平在CC、CT及TT基因型間依次增高，該結果與這3種基因型個體患哮喘的危險性依次增高是一致的，其中哮喘組血漿TIgE水平在CC、CT和TT基因型之間均有明顯差異(P<0.01)；攜帶T變異等位基因的哮喘兒童TIgE水平要明顯高于非攜帶的哮喘兒童(P<0.05)；提示當-590C/T位點為雜合子和/或突變型時TIgE水平明顯高于野生型，說明該位點多態性與血漿TIgE水平與哮喘相關。

綜上所述， IL-4基因-590C/T位點T等位基因與哮喘的發病有相關性，IL-4基因-590C/T位點變異基因T與血漿TIgE水平升高可能相關，該位點的多態性可能是貴陽地區哮喘的重要候選基因。

參考文獻4

[1] 中華醫學會呼吸分會．支氣管哮喘防治指南診斷標準[J]．中華結核和呼吸雜志， 2008(3)：177-185.

[2] Bateman ED,Hurd SS,Barnes PJ.Global strategy for asthma management and prevention:GINA executive summary[J].Eur Respir J, 2008:143-78.

[3] Steinke JW，Rich SS，Borish L.Genetics of allergic disease[J].J Allergy Clin Immunol， 2008(2 Suppl):S384-387.

[4] Zhang J,Paré PD,Sandford AJ.Recent advances in asthma genetics[J].Respir Res, 2008:4.

[5] Bousquet J,Demoly P,et al.Specific immunotherapy in rhinitis and asthma[J].Ann Allergy Asthma Immunol, 2009:38-42.

[6] Choi WA,Kang MJ,Kim YJ,et al.Gene-gene interactions between candidate gene polymorphisms are associated with tatol IgE levels in Korean children with asthma[J].J Asthma, 2012:243-252.

[7] Rosenwasser LJ，Klemm DJ，Dresback JK，et al.[J].Clin Exp Allergy， 1995(2):74-78.

[8] Sandford AJ，Chagani T，Zhu S，et al. Polymorphisms in the IL4，IL4RA，and FCERIB genes and asthma severity[J]. J Allergy Clin Immunol， 2000(1 pt 1)：135-140.

[9] Micheal S,Minhas K,Ishaque M,et al.IL-4 Gene Polymorphisms and Their Association With Atopic Asthma and Allergi Rhinitis in Pakistani Patients[J]. J Investig Allergol Clin Immunol, 2013(2): 107-111.

[10]黃花榮，吳敬芳.IFN-γ與IL-4基因多態性與兒童哮喘易感性及外周血INF-γ、IL-4和IgEd關系[J].中國病理生理雜志， 2010(9)：1769-1775.

[11]張嘉琳，陳虹，胡良平，等．白細胞介素4和lO基因多態性與兒童哮喘的相關性及對細胞因子表達的影響[J]．中華醫學雜志， 2002：114-118.

(2014-09-15收稿，2014-11-18修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

Correlation between Polymorphism of -590C/T in IL-4 Gene

Promoter and Plasma IgE Levels in Asthma Children

ZENG Yan1, DENG Shenglan1， LI Bo1, YANG Jun1, CUI Yuxia2， LU Gen3， ZHU Xiaoping1

(1.DepartmentofPediatrics,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China;2.People'sHospital

ofGuizhouProvince,Guiyang550002,Guizhou,China; 3.Children'sHospital

ofGuiyangCity,Guiyang550003,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the correlation between the single nucleotide polymorphisms (SNP) of -590C/T in the promoter region of IL-4 gene and asthma children in Guiyang, and to study the impact of this polymorphism on total plasma IgE (TIgE) levels. Methods: Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) was used to detect -590C/T polymorphism of 250 children with asthma in Guiyang and 200 healthy children. The TIgE levels were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The TIgE levels were compared among children with different -590C/T genotypes. Results: There were three genotypes in -590C locus of IL-4 gene: CC, CT and TT, significant differences were found in genotypic frequency between the two groups (χ2=13.395，P<0.01). The C allele frequencies and the T allele frequencies had significant differences between the two groups(χ2=16.384， P<0.01). Compared with CC and CT genotypes in this locus, the risk of developing asthma of TT carrier was significantly higher (OR=1.78，95%CI=l.22~2.60), and mutant T allele increased the risk of developing asthma(χ2=9.851，P<0.01; OR=1.82，95%CI=1.36~2.44).With the same genotype and locus, the TIgE levels of asthma children were higher than those of control (P<0.05)，and there were significant differences in TIgE levels between subjects with or without mutant T allele in asthma group (t=1.978，P<0.05), but there was no significant difference in TIgE levels between subjects with or without mutant T allele in control group (t=0.249，P>0.05).Conclusions: T allele in -590C locus of IL-4 gene is associated with asthma, and mutant T allele is correlated with increasing of TIgE levels.

[Key words]child; bronchial asthma; inlerleukin-4; polymorphism,single nucleotide; immunoglobulin E

[中圖分類號]R725.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0032-04

通信作者**E-mail:zxp1963819@163.com網絡出版時間：2015-01-13

[基金項目]*貴州省科技廳社會發展 [黔科合SY(2010)3018號]；貴陽市科技局社會發展領域科技攻關項目(2010筑科農合同字第1-社-23號)