紅絲線草對肝纖維化大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1表達的影響

網絡出版時間：2015-01-13　網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1755.001.html

李志超， 黃俊敏， 李紅莉

(唐山市玉田縣中醫醫院， 河北 玉田　064100)

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紅絲線草對肝纖維化大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1表達的影響

網絡出版時間：2015-01-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1755.001.html

李志超， 黃俊敏， 李紅莉

(唐山市玉田縣中醫醫院， 河北 玉田064100)

[摘要]目的： 觀察中藥紅絲線草對肝纖維化大鼠肝組織中基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)及基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)蛋白表達的影響。方法： 將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組、紅絲線草高、中、低劑量組共6組，每組10只；除正常組外，其余各組大鼠用二甲基亞硝胺(DMN)制作肝纖維化模型；正常組和模型組大鼠用等體積生理鹽水喂養，秋水仙堿組、紅絲線草高、中、低劑量組分別給予秋水仙堿0.1 mg/kg和高、中、低劑量紅絲線草喂養各組大鼠，4周后處死，取大鼠肝臟，采用免疫組織化學方法檢測各組大鼠肝組織中MMP-1及TIMP-1蛋白的表達。結果： 模型組MMP-1表達明顯低于正常組(t=2.57，P<0.05)，TIMP-1表達明顯高于正常組(t=7.26，P<0.05)；與模型組比較，紅絲線草高、中劑量組大鼠肝組織中MMP-1蛋白表達明顯升高(t=2.77和2.68，P<0.05)，TIMP-1蛋白表達明顯降低(t=2.76和3.63，P<0.05)；紅絲線草低劑量組MMP-1及TIMP-1蛋白表達與模型組比較，差異無統計學意義(t=1.16和1.41，P>0.05)；紅絲線草高、中劑量組肝組織中MMP-1及TIMP-1蛋白表達與秋水仙堿組比較，差異無統計學意義(t=1.29、2.68、0.05、0.16，P>0.05)。結論： 紅絲線草抗肝纖維化機制可能與MMP-1及 TIMP-1表達水平有關。

[關鍵詞]肝纖維化； 免疫組織化學； 基質金屬蛋白酶； 基質金屬蛋白酶抑制劑； 紅絲線草

肝纖維化是肝細胞外基質降解減少，合成增加，導致纖維結締組織增生，甚至形成假小葉?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-s，MMPs)和基質金屬蛋白酶抑制劑(tissueinhibitor of matrix metalloproteinase-s,TIMPs)已被證實在肝纖維化中發揮重要作用，是調節肝細胞外基質降解與合成的重要因子。目前，肝纖維化的治療尚無特效藥。近年研究顯示，中醫藥在肝纖維化的治療方面具有很大優勢[1]。紅絲線草屬爵床科紅絲線草屬植物，具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗病毒的作用，紅絲線草內的多糖等有效成分還具有保肝、護肝、防治肝纖維化的作用[2-4]。因此，本研究通過觀察紅絲線草對肝纖維化大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1蛋白表達的影響，探討紅絲線草防治肝纖維化的機制。

1材料與方法

1.1動物與試劑

SPF級雄性SD大鼠60只購自北京實驗動物中心， 紅絲線草乙醇總提取物由玉田縣中醫院藥劑科提供，MMP-1，TIMP-1多克隆抗體，兔 SPkit 及DAB均購自武漢博士德有限公，秋水仙堿粉劑購自serva公司，二甲基亞硝胺(DMN，純度99%)購自天津市化學試劑研究所。

1.2方法及動物模型

大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組、紅絲線草高劑量組、紅絲線草中劑量組、紅絲線草低劑量組，共6組，每組10只。模型組、秋水仙堿組及紅絲線草3個劑量組大鼠制作肝纖維化模型：造模周期為4周，腹腔注射0.5% 二甲基亞硝胺(2 mL/kg DMN)，每天1次，連續 3 d，停藥 4 d，第1周用常規劑量的2/3。藥物干預：秋水仙堿組劑量為0.1 mg/kg，紅絲線草高劑量組為300 mg/kg、中劑量組200 mg/kg、低劑量組100 mg/kg ，灌胃給藥, 每天1次；正常組和模型組用等體積生理鹽水代替。6組大鼠均采用普通飲食飼養，自由飲水。4周后處死大鼠，肝臟常規取材，10%甲醛固定，脫水、包埋、切片, 免疫組織化學染色(EnVision法)。用已知陽性片作陽性對照, PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3觀察指標

結果判定：MMP-1及TIMP-1均以胞質或胞膜中出現棕黃色、棕褐色顆粒為陽性細胞；按染色強度打分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽性細胞所占百分比打分：0分為陰性，1分為<10%，2分為11%~50%，3分為51%~75%，4分為>75%。將染色強度分數與陽性細胞所占百分比分數相加，計算每張切片的表達分值。

1.4統計學方法

2結果

除正常組外，各組大鼠在實驗中均有死亡。模型組MMP-1蛋白表達明顯低于正常組(t=2.57，P<0.05)，TIMP-1蛋白表達明顯高于正常組(t=7.26，P<0.05)；與模型組比較，紅絲線草高、中劑量組大鼠肝組織中MMP-1蛋白表達明顯升高(t=2.77和2.68，P<0.05)，TIMP-1蛋白表達明顯降低(t=2.76和3.63，P<0.05)；紅絲線草低劑量組MMP-1及TIMP-1蛋白表達與模型組比較，差異無統計學意義(t=1.16和1.41，P>0.05)；紅絲線草高、中劑量組肝組織中MMP-1及TIMP-1蛋白表達與秋水仙堿組比較，差異無統計學意義(t=1.29、2.68、0.05、0.16，P>0.05)。見表1、圖1和圖2。

表1　各組大鼠肝臟組織中MMP-1和TIMP-1表達

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

注：A為正常組，B為秋水仙堿組，C為模型組，D、E、F分別為紅絲線草高、中、低劑量組圖1　各組大鼠肝組織中MMP-1表達(EnVision，×100)Fig.1　The expression of MMP-1 in liver tissue of rats in each group

注：A為正常組，B為秋水仙堿組，C為模型組，D、E、F分別為紅絲線草高、中、低劑量組圖2　各組大鼠肝組織中TIMP-1的表達(EnVision，×100)Fig.2　The expression of TIMP-1 in liver tissue of rats in each group

3討論

肝纖維化是肝炎、飲酒、高脂等不良刺激的代償反應，具有可逆性，其機制為細胞外基質的生成與降解失衡，引起細胞外基質積累，甚至肝硬化。肝細胞外基質降解受到MMP和TIMPS調節，MMPS促進肝細胞外基質的降解，TIMPS可通過抑制MMPS的表達，從而使肝細胞外基質降解減少。MMP-1和TIMP-1被公認在調節細胞外基質方面發揮關鍵作用，能夠準確反應肝細胞外基質的降解與合成情況。研究表明，肝纖維化時，MMP-1活性抑制，TIMP-1表達增加，使肝細胞外基質降解減少，促進肝纖維化的發展[5-6]。研究表明，紅絲線草提取物具有保肝、護肝的作用，還有降糖、降脂、降酶，減少脂肪在肝細胞內的沉積，防止脂肪肝形成的作用[2，7]。本實驗前期研究證實，紅絲線草能夠降低DMN誘導的肝纖維化大鼠血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、透明質酸及層粘連蛋白水平，HE切片觀察紅絲線草干預的肝纖維化大鼠肝組織的炎癥程度和纖維化程度明顯好于模型組，作用機制與降低TGF-β1蛋白表達有關。秋水仙堿是治療肝纖維化的有效藥物，因此，本實驗增加秋水仙堿組，作為陽性藥物組與其它各組比較。本實驗采用免疫組織化學方法，通過觀察各組大鼠肝組織MMP-1、TIMP-1蛋白的表達，探討紅絲線草對肝細胞外基質的降解與合成的影響。本研究結果顯示，模型組大鼠MMP-1蛋白表達明顯低于正常組，TIMP-1蛋白表達明顯高于正常組，證實MMP-1及TIMP-1蛋白在肝纖維化的發生發展中的確發揮著一定作用；與模型組比較，紅絲線草高、中劑量組大鼠肝組織中MMP-1蛋白表達明顯升高，TIMP-1蛋白表達明顯降低，提示紅絲線草可能通過降低TIMP-1，提高MMP-1表達，促進肝細胞外基質的降解，減少肝細胞外基質的合成，防止肝細胞外基質過度沉積，從而起到防治肝纖維化的作用。

參考文獻4

[1] 廖昭名,江峰,葉永安,等.抗纖抑癌方對肝纖維化大鼠肝組織基質金屬蛋白酶表達的影響[J].中醫藥臨床雜志, 2009(1): 63-65.

[2] 皮慧芳，楊希雄，阮漢利，等.紅絲線草保肝護肝活性部位的篩選[J].中國醫院藥學雜志， 2007(2)：172-173.

[3] 黃俊敏，李志超. 紅絲線草對大鼠肝纖維化的作用研究[J].四川中醫， 2012(12)：54-56.

[4] 黃俊敏，李志超，李紅利，等.紅絲線草對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1及VEGF蛋白表達的影響[J].標記免疫分析與臨床， 2013(2)：96-99.

[5] 鄭偉達,王小眾.基質金屬蛋白酶及其抑制物與實驗性肝纖維化[J].世界華人消化雜志, 2004(2):428-430.

[6] Eatall R,Brenner DA.Liver fibrosis [J].J Clin investing, 2005(2):209-219.

[7] 劉月麗，呂俊華.紅絲線草提取物對胰島素抵抗性脂肪肝大鼠肝臟保護作用的研究[J].中國中藥雜志， 2007(10)：940-942.

(2014-10-01收稿，2014-12-29修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Effect ofPeristrophejaponicaon the Expression of MMP-1 and

TIMP-1 in Hepatic Tissue of Hepatic Fibrosis Rats

LI Zhichao, HUANG Junmin，LI Hongli

(YutianHospitalofTraditionalChineseMedicine,Yutian064100,Hebei,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Peristrophe japonica on the expression of MMP-1and TIMP-1 in hepatic fibrosis rats induced by Dimethylnitrosamine (DMN). Methods: Sixty SD rats were divided randomly into six groups: normal control group, model group, positive control group (colchicin group), and Peristrophe japonica treated groups including high (group H), middle (group M) and low (group L) doses, with 10 rats in each group. Except normal control group, the other groups were induced to construct hepatic fibrosis model with 0.5% dimethyl nitrosamine (DMN). After model was constructed, positive control group was fed with 0.1 mg/kg colchicin; group H, group M and group L were fed with high, middle and low doses of Peristrophe japonica respectively, while normal control group and model group were fed with equal volume of saline. The rats in all groups were executed 4 weeks later, and the expression levels of MMP-1, TIMP-1 in liver tissue of rats were measured by immunohistochemistry. Results: In model group, the expression level of MMP-1 protein was obviously lower than that of normal control group (P<0.05), and the expression level of TIMP-1 protein was obviously higher than that of normal control group (P<0.05). Compared with those of model group, MMP-1 protein expression levels in groups H and M were significantly higher(t=2.77 and 2.68，P<0.05), and the TIMP-1 protein expression levels were significantly lower (t=2.76 and 3.63，P<0.05). In group L, the expression levels of the 2 proteins were not obviously different from those of model group (t=1.16 and 1.41，P>0.05). The expression levels of the 2 proteins in groups H and M did not differ significantly from that in group colchicin. Conclusion: The anti hepatic fibrosis mechanism of Peristrophe japonica may relate to the expression of MMP-1 and TIMP-1.

[Key words]hepatic fibrosis; immunohistochemistry; matrix metalloproteinase-1; tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1; peristrophejaponica

[中圖分類號]R361.3; R286.5; R575

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0052-04