強直性脊柱炎患者不同活動期Treg、Th17細胞的臨床意義及其相關性*

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強直性脊柱炎患者不同活動期Treg、Th17細胞的臨床意義及其相關性*

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1835.008.html

王作龍1, 鐘乃風2, 馬莉1**

(1.貴陽醫(yī)學院附院 中心實驗室, 貴州 貴陽550004； 2.貴陽醫(yī)學院 生物與工程學院生物技術教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討強直性脊柱炎(AS)不同活動期調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)的臨床意義，分析兩者之間的相關性。方法: 78例AS患者(AS組)分為低活動性AS組和高活動性AS組，30例健康體檢者作為對照組，抽取兩組受檢者外周血，應用細胞內(nèi)因子染色技術及流式細胞術檢測外周血Treg和Th17細胞數(shù)量，分析Treg和Th17與AS活動性的相關性。結果: 與對照組相比，AS組和低活動性AS組外周血Treg細胞百分率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高活動性AS組外周血Treg細胞百分率明顯降低(P<0.01)，AS組外周血Th17細胞百分率增高(P<0.01)，且低活動性AS組和高活動性AS組外周血Th17細胞百分率均增高(P<0.05)，AS組、低活動性AS組以及高活動性AS組外周血Th17/Treg的細胞比值均有增高(P<0.01)；與低活動性AS組相比，高活動性AS組外周血Treg細胞明顯減少(P<0.01)，高活動性AS組外周血Th17細胞明顯增高(P<0.01)，高活動性AS組外周血Th17/Treg的細胞比率明顯增高(P<0.01)；相關性分析顯示，AS患者外周血Th17細胞比例與Bath強直性脊柱炎病情活動指數(shù)(BASDI)呈正相關，(r=0.409)Treg細胞比例與BASDI呈負相關(r=-0.265)，Th17/Treg比率與BASDI相關性分析呈顯著正相關(r=0.459，P<0.01)。結論: AS患者外周血Treg、Th17細胞數(shù)量的改變，與AS的發(fā)生、發(fā)展有明顯相關性，檢測AS患者外周血Treg、Th17細胞的數(shù)量以及Thl7/Treg的比率有助于AS病情的判斷。

[關鍵詞]輔助性T細胞17； 調(diào)節(jié)性T細胞； 脊柱炎，強直性； 免疫，細胞； 自身免疫疾病

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性自身免疫性疾病,其準確的發(fā)病機理目前尚未可知[1]。病因有遺傳假說、DNA甲基化、細菌感染假說、免疫假說，未折疊蛋白反應假說等[2-3]。有文獻報道在AS的發(fā)生和發(fā)展中，T細胞亞群失衡起到了關鍵作用[4]。按照 CD4+T 細胞分化和功能性將其分為輔助性T細胞17(Th17)及發(fā)揮負調(diào)節(jié)功能的T細胞(regulatory T cells，Treg)等亞群。有研究發(fā)現(xiàn)AS患者外周血Th17細胞明顯增高而Treg細胞降低，本研究通過檢測AS患者外周血中Treg、Th17及其Th17/Treg比率，分析其與AS活動性的相關性，為AS的臨床診斷及治療提供新思路和新方法。

1材料與方法

1.1研究對象

78例AS患者作為研究組，30例健康體檢者作為對照組。AS患者中男性65例，女性13例，年齡17～53歲，平均(26±7.8)歲；患者均為HLA-B27陽性，均符合1984年紐約修訂的AS的診斷標準，均未經(jīng)任何治療。排除標準：就診前6個月內(nèi)未用過糖皮質激素，排除合并其他與AS相關的疾病(肝硬化、腫瘤等)，無風濕病及其他自身免疫病。抽血前，所有AS受試者均自愿簽署知情同意書，填寫病例調(diào)查表以及Bath AS功能指數(shù)(BASFI)、Bath AS病情活動指數(shù)(BASDAI)表格。依據(jù)Bath AS病情活動指數(shù)，將AS組分為低活動性AS組(BASDI<4分，44例)、高活動性AS組(BASDI≥4分，34例)。兩組患者年齡及性別構成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.815)。30名健康體檢者中男性16名、女性14名，年齡15～52歲，平均(25±8)歲，無HIV感染，無重大疾病史。對照組與AS組年齡及性別構成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1標本采集受檢者均于早上8～10時空腹抽取靜脈血2～3 mL于EDTA-K2抗凝管中，2 h內(nèi)檢測Th17、Treg細胞。

1.2.2細胞體外刺激活化取上述經(jīng)EDTA-K2抗凝的靜脈血，用淋巴細胞液分離密度梯度離心法獲取單個核細胞，RPMI 1 640調(diào)整細胞濃度至2×106/mL,接種于6孔培養(yǎng)板，加入莫能霉素，使最終濃度分別為1.7 g/L、加入離子霉素，使最終濃度分別為1 g/L，加入佛波酯，使最終濃度分別為0.05 g/L。再進行37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h。以上所用試劑均購自美國BD公司。

1.2.3CD 69檢測通過檢測CD3+CD8-T淋巴細胞膜表面的CD 69表達，以衡量激活效果。當CD 69表達>90%(圖1)方可進行Th17細胞的檢測。

1.2.4Th17細胞檢測取2支試管，標記為同型管及陽性管，并分別加入CD3-FITC、CD8-PECy7抗體各20 μL，然后加入已刺激培養(yǎng)5 h的全血50 μL，混勻，室溫避光孵育15 min；加入溶血素800 μL，混勻避光溶血3 min，再轉入37 ℃水浴箱中孵育5 min，加入PBS 1 mL，混勻后1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復1次。加入破膜劑1 mL，混勻，45 min破膜，1 000 r/min離心5 min，棄上清，對應加入抗體標記的同型對照(-)、Th17(+)，混勻，室溫避光孵育15 min；加入PBS緩沖液1 mL，充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復1次；棄上清液，加入適量PBS充分混勻，上機檢測。Th17細胞的結果分別以CD3+CD8-IL-17+細胞的百分率表示。

1.2.5Treg 細胞檢測取2支試管，第1管做同型對照并加入IgG1-APC、IgG2a-Alexflour672抗體20 μL，第2管加入Treg Cocktail(CD4-FITC、CD25-APC、CD127-Alexflour672)20 μL，再分別加入EDTA-K2抗凝外周血50 μL，漩渦混合器充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入800 μL溶血素，充分混勻，避光溶血3 min，再轉入37 ℃水浴箱中5 min，加入PBS緩沖液1 mL,1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復一次，棄上清液，加入適量PBS充分混勻，上機檢測。Treg細胞的結果以CD4+CD127LOWCD25+細胞的百分率表示。

1.3統(tǒng)計學分析

2結果

2.1Th17、Treg細胞

與對照組相比，AS組和低活動性AS組外周血Treg細胞百分率均無顯著差異(P>0.05)，高活動性AS組外周血Treg細胞百分率明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，AS組外周血Th17細胞百分率增高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，且低活動性AS組和高活動性AS組外周血Th17細胞百分率均增高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，AS組、低活動性AS組、高活動性AS組外周血Th17/Treg的細胞比值均增高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與低活動性AS組相比，高活動性AS組外周血Treg細胞百分率明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，高活動性AS組外周血Th17細胞百分率明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，高活動性AS組外周血Th17/Treg的細胞比值明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1、圖2。

2.2Th17、Treg細胞與AS活動性的相關性

AS患者外周血Th17細胞比例及Th17/Treg與Bath強直性脊柱炎病情活動指數(shù)(BASDI)呈正相關(r=0.409,r=0.459，P<0.01)；Treg細胞比例與BASDI呈負相關(r=-0.265，P<0.05)。

表1　AS組及正常對照組外周血中Treg、Th17細胞

(1)與正常對照組比較，P<0.01；(2)與低活動性AS組比較，P<0.01

3討論

AS是一種嚴重的慢性炎性自身免疫性疾病，對患者的工作和生活造成了嚴重影響，同時也給患者的家庭和社會帶來了沉重的負擔，多發(fā)于男性青壯年，發(fā)病的高峰年齡為20～30 歲。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性Treg細胞在胸腺中分化和成熟，是一組具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞群[1]。通過細胞接觸依賴機制或抑制性細胞因子依賴機制，主動抑制自身免疫性T淋巴細胞的活化，維持自身免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。王朋等[5]發(fā)現(xiàn)AS患者Treg細胞上調(diào)，Crispin等[6]研究結果恰好與之相反。本研究結果顯示，AS患者外周血Treg細胞低于健康對照組，與Crispin等的結論相符。

注：a為淋巴細胞收集圖，b為CD3+CD8-的細胞，c為CD3+CD8-CD69-細胞，d為CD3+CD8-CD69+細胞圖1　流式細胞術檢測CD3+CD8-CD69+細胞(CD69細胞)設門分析方法Fig.1　determination of CD3+CD8-CD69+cells (CD69cells) with flow cytometry

注：a為正常對照，b為低活動性AS，c為高活動性AS圖2　Th17和Treg細胞百分率(流式細胞術)Fig.2　The percentage ofTh17and Treg cells

Th17細胞具有分化白細胞介素(interleukin，IL)23依賴性，產(chǎn)生IL-17，而不產(chǎn)生γ-干擾素為特征的T細胞亞群，通過分泌促炎細胞因子IL-17，確保中性粒細胞分化、成熟和活化，刺激單核細胞和成纖維細胞活化來參與AS炎癥反應[7]。本研究中AS患者外周血Th17細胞與AS活動性呈正相關(P<0.01),但低活動性AS組外周血Th17細胞增高并不明顯，高活動性AS組外周血Th17細胞明顯增高，提示Th17細胞主要介導AS活動期的炎癥反應，并參與疾病的進展。本研究還發(fā)現(xiàn)Th17/Treg失衡與Th17數(shù)量增加優(yōu)勢及Treg細胞數(shù)量減少有關，與LangrishCL等結論一致[1]。進一步研究顯示，外周血Treg細胞的這種減低在AS低活動性組無統(tǒng)計學意義，但在AS高活動性組存在顯著差異，提示AS疾病早期Treg細胞仍能正常行使反饋功能，抑制炎性反應，隨疾病活動性增強優(yōu)勢促炎細胞因子的作用下，如IL-6，刺激了Thl7細胞分化，抑制了Treg細胞的分化[8]。本研究中，AS患者Treg細胞與AS活動性呈負相關，檢測AS患者外周血Treg細胞可作為判斷AS疾病活動性的參考指標。但單獨比較Th17細胞或Treg細胞與疾病活動性的相關性不及Th17/Treg細胞比率，聯(lián)合檢測Th17、Treg細胞，比較Th17/Treg細胞的失衡對研究AS疾病活動監(jiān)測意義更大。

Th17、Treg細胞在人體復雜的免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用，糾正細胞失衡、調(diào)節(jié)其功能是治療AS的可能策略，能達到誘導病情緩解、減輕關節(jié)炎癥反應的作用[9]。Th細胞功能失衡進而導致AS的發(fā)生、發(fā)展，故可通過檢測Th17、Treg、細胞及Th17/Treg比例，監(jiān)測AS患者的治療及疾病活動情況。

綜上所述，AS患者存在Th17、Treg細胞的失衡，隨著AS疾病活動度的增高，患者體內(nèi)Th17細胞介導的細胞免疫功能亢進，而Treg細胞介導的免疫抑制作用減弱，聯(lián)合檢測AS患者外周血Th17、Treg細胞有助于AS病程監(jiān)測，對AS臨床治療有重要意義。因此，Th17、Treg細胞及Th17/Treg比例有望成為臨床判斷AS病情的有效指標，可能為AS診療提供新思路。

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(2014-09-29收稿，2014-11-03修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

·臨床研究·

A Study on the Clinical Value and Correlation of Treg and Th17

Cells among Different Active Stages of Ankylosing Spondylitis

WANG Zuolong1， ZHONG Naifeng2， MA Li1

(1.CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Department

ofBiotechnology,SchoolofMedicalBioengineeringofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the clinical significance and correlation of T helper cells 17(Th17) and regulatory T cells(Treg) in different stages of patients with ankylosing spondylitis(AS) . Methods: A total of 78 peripheral blood samples were taken from AS patients，the AS group was divided into low-activity AS group and high-activity AS group, 30 healthy peripheral blood samples serves as control group. Th17 and Treg numbers were detected by flow cytometry(FCM ) and intracellular cytokine staining technique(ICS) to study the relationship between Treg, Th17 cells and AS activity. Results: Compared with the control group, the percentage of Treg cells in AS group and low-activity AS group had no significant difference (P>0.05), high-activity AS group peripheral blood Treg cells were significantly reduced(P<0.01).The percentage of Th17 cells in AS group increased(P<0.01), peripheral blood Th17 percentage of low-activity AS group and high-activity AS group were increased(P<0.05), and the ratios of Th17/Treg in AS group , low-activity AS group and high-activity AS group were increased(P<0.01).The ratio of Treg cells of high-activity AS group was significantly lower than that of low-activity AS group(P<0.01); the ratio of Th17 cell of high-activity AS group was significantly higher than that of low-activity AS group(P<0.01); the ratio of peripheral blood Th17/Treg cell of high-activity AS group was significantly higher than that of low-activity AS group(P<0.01). There were positive correlation of Bath ankylosing spondylitis disease activity index (BASDI) with peripheral blood Th17 cell ratio and Th17/Treg ratio of AS patients, negative correlation between BASDI and Treg cells ratio of AS patients(P<0.05). Conclusions: Changes of the amount of Treg and Th17 cells is related to the occurrence and development of AS. The amount of Treg and Th17 and the ratio of Th17/Treg can contribute to diagnose AS patient condition and serve as the treatment target of AS.

[Key words]T helper cells 17； regulatory T cells； spondylitis， ankylosing; immunity,cellular; autoimmune diseases

[中圖分類號]R446.62

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0068-04

通信作者**E-mail:18608505639@163.com網(wǎng)絡出版時間：2015-01-13

[基金項目]*貴州省科技廳社會發(fā)展攻關項目[黔科合LG字(2011)034號]