結直腸癌組織中K-ras基因突變情況及其臨床意義

劉珊，王丹，盧福昱，程波，石建玲，段戀，孫鎖柱(第二炮兵總醫院，北京00088;解放軍第30醫院)

結直腸癌組織中K-ras基因突變情況及其臨床意義

劉珊1，王丹1，盧福昱2，程波1，石建玲1，段戀1，孫鎖柱1(1第二炮兵總醫院，北京100088;2解放軍第302醫院)

摘要:目的觀察K-ras基因在結直腸癌組織中的突變情況，為臨床開展結直腸癌個體化治療提供依據。方法收集156份結直腸癌組織手術標本作為觀察組，20份正常腸黏膜標本作為對照組。提取組織DNA，采用實時熒光定量PCR法檢測K-ras基因突變情況。分析K-ras基因突變率及第12、13位密碼子突變與結直腸癌患者臨床病理特征的關系。結果對照組未檢測出K-ras基因突變，觀察組K-ras基因突變率為40.4%(63/156)，兩組基因突變率比較，P＜0.05。K-ras基因突變率與結直腸癌患者性別、腫瘤部位、分化程度、病理分期、淋巴結轉移及遠處轉移無關(P均＞0.05)，與年齡有關(P＜0.05)。觀察組K-ras基因第12、13位密碼子突變率分別為76.2%(48/ 63)和27.0%(17/63)，二者比較P＜0.05。觀察組K-ras基因第12、13位密碼子突變與結直腸癌患者腫瘤分化程度相關(P＜0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位、病理分期、淋巴結轉移及遠處轉移無關(P均＞0.05)。結論結直腸癌組織中K-ras基因突變率為40.4%，第12位密碼子(GGT～GAT)突變是最常見類型。檢測K-ras基因突變情況有助于指導臨床開展結直腸癌個體化治療。

關鍵詞:腸腫瘤;結直腸癌; K-ras基因;基因突變

K-ras genemutations in colorectal carcinoma and its clinical significance

LIU Shan1，WANGdan，LU Fu-yu，CHENG Bo，SHI Jian-ling，DUAN Lian，SUN Suo-zhu(1 General Hospital of the Second Artillery，Beijing 100088，China)

Abstract:Objective To observe the K-ras genemutations in the colorectal carcinoma tissues and to provide basis for the individualized treatment of colorectal cancer in clinical.Methods A total of 156 cases of colorectal carcinoma samples(observation group)and 20 cases of normal tissue samples(the control group)were collected.GenomicdNA was extracted and K-ras genemutations were analyzed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Then，we analyzed the K-ras genemutation rate.Meanwhile，the 12th and 13th codonmutations in colorectal cancer and the relationships with clinicopathologic features were analyzed.ResultsThe K-ras genemutations were not found in the control group，and K-ras genemutation rate in the observation group was 40.4%(63/156).Significantdifference was found in themutation rate between these two groups(P＜0.05).The K-ras genemutation rate was not related with sex，tumor location，tumor grade，pathological stage，lymph node and lymph nodemetastasis(all P＞0.05)，but was related with age(P ＜0.05).Themutation rate at codon 12 and codon 13 of K-ras gene was 76.2%(48/63)and 27.0%(17/63)，respectively in the observation group，and significantdifference was found(P＜0.05).Themutation at codon 12 and codon 13 of K-ras gene was related with tumordifferentiateddegree(P＜0.05)，but not related with sex，age，tumor location，pathological stage，lymph node and lymph nodemetastasis(all P＞0.05).Conclusions K-ras genemutation rate in the colorectal carcinoma tissues is 40.4%，and themost common type is the codon 12(GGT-GAT)mutation.Thedetection of K-ras genemutation helps to provide basis for the individualized treatment of colorectal cancer in clinical.

Key words:intestinal neoplasms; colorectal carcinoma; K-ras gene; genemutation

在散發性結直腸癌的研究中，K-ras基因突變被認為是腫瘤發生的早期事件，并在腫瘤發展、轉移、復發等階段起重要作用［1～3］。本研究觀察了結直腸癌根治術癌組織中K-ras基因突變狀況，并探討其與結直腸癌患者臨床病理特征的關系，旨在為結直腸癌的個體化治療提供依據。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2010年1月～2012年11月第二炮兵總醫院手術切除所得的結直腸癌根治病理標本156份作為觀察組，患者男88例、女68例，年齡20～89歲、中位年齡68歲;腫瘤位于結腸76例，直腸80例;均經手術、病理檢查證實診斷。按2008 年IARC出版的WHO消化系統腫瘤分類標準及病理分期標準，高度化14例、中度分化121例、低度分化20例;病理分期(pTNM分期)Ⅰ期29例，Ⅱ期47例，Ⅲ期69例，Ⅳ期11例;有淋巴結轉移72例、無淋巴結轉移84例。選擇同期20份正常人腸黏膜組織作為對照組。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 K-ras基因突變檢測采用實時熒光定量PCR法。兩組標本經10%中性甲醛固定及石蠟包埋，10 μm厚切片，取10張，確保觀察組切片含有70%以上的腫瘤組織。DNA提取:使用德國Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取石蠟標本基因組DNA。實時熒光定量PCR:采用的PCR儀為Applied Biosystems公司的7500型實時熒光定量PCR儀。參照武漢友芝友醫療科技有限公司的人類K-ras基因7種突變檢測試劑盒進行。主要步驟:于0.2mL的離心管中依次加入PCR buffer 22.3 μL、酶混合物0.2 μL、參比染料0.4 μL、內標模板0.1 μL、待測腫瘤組織DNA 2 μL，總反應體積為25 μL。反應條件:預變性95℃、5min，然后95℃、15 s，60℃、60 s，共40個循環。陰性質控標準品采用滅菌雙蒸水。

1.3統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計數資料以率表示，組間比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 K-ras基因突變情況對照組未檢測出K-ras基因突變，均為野生型;觀察組K-ras基因突變率為40.4%(63/156);兩組基因突變率比較，P＜0.05。觀察組共檢測出突變型K-ras的5種類型，依次為第12位密碼子GGT→GAT，為39.7%(25/63)，第13位密碼子GGC→GAC，為27.0%(17/63)，第12位密碼子GGT→GTT，為22.2%(14/63)，第12位密碼子GGT→AGT，為7.9%(5/63)，第12位密碼子GGT→TGT，為6.3%(4/63)。觀察組K-ras基因第12、13位密碼子突變率分別為76.2%(48/63)和27.0%(17/63)，兩者比較P＜0.05。突變均為雜合性體細胞錯義突變，未發現胚系(純合)基因突變。有2例出現第12、13位密碼子同時突變的復合突變，且均為GGT→GAT、GGC→GAC。

2.2 K-ras基因突變與結直腸癌患者臨床病理特征的關系K-ras基因突變與結直腸癌患者年齡有關(P＜0.05)，而與性別、腫瘤部位、分化程度、病理分期、淋巴結轉移及遠處轉移無關(P均＞0.05)。詳見表1。

表1　K-ras基因突變與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

2.3觀察組K-ras基因突變位點與患者臨床病理特征的關系觀察組K-ras基因第12位與第13位密碼子突變在腫瘤分化程度上比較差異有統計學意義(P＜0.05)，而在性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移等因素上比較差異無統計學意義(P均＞0.05)。詳見表2。

3　討論

國外研究報道，結直腸癌K-ras基因突變率為30%～60%，東方人種略低于西方國家(25%～43%)，但無明顯統計學差異［4，5］。結直腸癌中K-ras基因突變主要集中在1號外顯子的12、13密碼子上，少數存在2號外顯子61、63密碼子的突變［6］。數據顯示12密碼子發生突變頻率最高，達70%以上，西方國家以GGT→GTT最常見，而亞洲以GTT→GAT最常見。本研究對照組未檢測出K-ras基因突變，觀察組K-ras基因突變率為40.4%，以第12位密碼子GTT→GAT突變比例最高，均與以往研究報道一致。提示K-ras基因突變可作為診斷結直腸癌的分子指標。本研究2例同時存在第12、13位密碼子復合突變，經過重復試驗結果相同，表明K-ras基因突變在結直腸癌發生、發展的整個過程中可能存在多個階段，發生多次不同突變的動態現象。

表2　觀察組K-ras基因突變位點與患者臨床病理特征的關系

以往研究對K-ras基因突變與患者臨床病理特征間的相關性研究結果不盡相同［7～10］。本研究結果顯示，K-ras基因突變與患者性別、腫瘤部位、分化程度、病理分期及有無淋巴結及遠處轉移無明顯相關性，尤其是在腫瘤轉移趨勢上沒有明顯相關性，與國內外的相關報道存在一定差異，我們認為可能與樣本量、檢測方法、人種差異性等原因有關。本研究結果顯示，K-ras基因突變與患者年齡相關，存在K-ras基因突變發生率隨患者年齡增加而逐步升高的趨勢(＜40歲年齡段突變率18.2%，＞60歲年齡段突變率48.4%)。多數學者認為，K-ras基因突變與結直腸癌預后不良密切相關，患者無法從靶向藥物中獲益，我國人口老齡化趨勢的逐年顯著使得結直腸癌的預后不良性更加明顯。

有研究認為，K-ras基因的第12、13位點突變提示預后不良，存在13位點突變的患者更容易復發［11～13］。本研究中，K-ras基因的第12與13位密碼子突變在腫瘤分化程度上比較差異有統計學意義，腫瘤在高分化狀態下幾乎全部出現第12位密碼子突變，而第13位密碼子突變在低分化時發生頻率較高，提示結直腸腺癌在分化程度逐步降低時可能出現了K-ras基因從12密碼子向13密碼子突變轉化的過程。由于腫瘤分化程度被普遍認為與分期、復發、轉移等預后因素密切相關，但能否認為K-ras基因第13位密碼子突變狀態的存在是預后不良的相關因素之一，仍需擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，K-ras基因是EGFR信號通路中最易發生突變的基因，并且在結直腸癌的發生、發展、轉移等各個階段起重要作用。深入研究K-ras基因的結構、功能及突變規律對結直腸癌的防治具有重要意義。

參考文獻:

［1］Shigenori K，Miho K，Shuhei T，et al.Prognostic value of KRAS and BRAFmutations in curatively resected colorectal cancer［J］.World Gastroenterology，2015，9(4): 1275-1283.

［2］Lea IA，JacksonmA，Li X，et al.Genetic pathways andmutation profiles of human cancers: site and exposure specific patterns［J］.Carcinogenesis，2007，28(9): 1851-1858.

［3］Ju Y，Yan L，Yun Q，et al.KRAS and BRAF genemutations anddNAmismatch repair status in Chinese colorectal carcinoma patients［J］.World Gastroenterology，2015，21(5): 1595-1605.

［4］Soeda H，Shimodaira H，Gamohm，et al.PhaseⅡTrial of Cetuximab plus Irinotecan for Oxaliplatin- and Irinotecan-Based Chemotherapy-Refractory Patients with Advanced and/ormetastatic Colorectal Cancer: Evaluation of Efficacy and Safety Based on KRASmutation Status(T-CORE0801)［J］.Oncology，2014，1:7-8.

［5］徐向明，張國良，李敏偉，等.結直腸癌組織中K-ras基因的檢測及其意義［J］.中華醫學雜志，2010，90(18): 1268-1271.

［6］Frattinim，Saletti P，Romagnani E，et al.PTEN loss of expression predicts cetuximab efficacy inmetastatic colorectal cancer patients ［J］.Brit J Cancer，2007，97(8): 1139-1145.

［7］Chun L，Jen L，Tzu L，et al.The prognostic role ofmicrosatellite instability，codon-specific KRAS，and BRAFmutations in colon cancer［J］.Surgical Oncology，2014，110(4): 451-457.

［8］Calistrid，Rengueci C，Seymour I，et al.Mutation analysis of p53，K-ras，and BRAF genes in colorectal cancer progression［J］.J Cell Physiol，2005，204(2): 484-488.

［9］Nur S，Yu F，Daniel L，et al.Non-invasive sensitivedetection of KRAS and BRAFmutation in circulating tumor cells of colorectal cancer patients［J］.Molecular Oncology，2015，9(4): 850-860.

［10］吳偉，胡錦林，鞠海星，等.散發性大腸癌K-ras基因點突變研究及其臨床病理意義［J］.醫學研究雜志，2010，39(12): 53-57.

［11］吳文輝，肖隆斌，湯友珍，等.K-ras基因突變與結直腸癌生物學行為的關系［J］.中國病理生理雜志，2009，25(11): 2159-2162.

［12］Conlin A，Smith G，Carey FA，et al.The prognostic significance of K-ras，p53，and APCmutations in colorectal carcinoma［J］.Gut，2005，54(9): 1283-1286.

［13］Pierre P，Deniz P，Corinne N，et al.Clinical Relevance of KRASMutated Subclonesdetected with Picodropletdigital PCR in Advanced Colorectal Cancer Treated with Anti-EGFR Therapy［J］.Clinical cancer research，2015，21(5): 1087-1097.

收稿日期:( 2015-07-04)

通信作者簡介:孫鎖柱(1968-)，男，主任醫師，研究方向為診斷病理學。E-mail:mingzhu0368@ sina.com

作者簡介:第一劉珊(1980-)，女，博士研究生，主治醫師，研究方向為分子病理學。E-mail: iceicequeen@ sina.com

基金項目:國家自然科學基金青年基金資助項目(8301662)。

文章編號:1002-266X(2015)36-0001-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.001