α硫辛酸對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)PKA-CREB信號通路的影響

楊麗萍，凌書建，張國華，王珊(邯鄲市中心醫(yī)院，河北邯鄲05600;河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院)

α硫辛酸對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)PKA-CREB信號通路的影響

楊麗萍1，凌書建1，張國華2，王珊2
(1邯鄲市中心醫(yī)院，河北邯鄲056001;2河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院)

摘要:目的探討α硫辛酸對Aβ1-42所致阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)PKA-CREB信號通路的影響。方法24只雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組和硫辛酸組各6只。模型組和硫辛酸組采用雙側(cè)海馬一次性注射Aβ1-42的方法建立AD模型。各組均采用Morris水迷宮行定位航行試驗和空間探索試驗，檢測記憶能力(逃避潛伏期)及學習能力(跨越平臺次數(shù));采用Western blotting法檢測海馬組織中蛋白激酶A(PKA)Ⅱα與p-CREB蛋白。結(jié)果與模型組比較，α硫辛酸組、對照組及假手術(shù)組逃避潛伏期明顯延長、跨越平臺次數(shù)明顯減少(P均＜0.01);海馬區(qū)組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達明顯升高(P均＜0.01)。其中α硫辛酸組海馬區(qū)組織PKAⅡα、p-CREB蛋白相對表達分別為0.739±0.417和0.380±0.329，明顯高于模型組0.520± 0.462、0.219±0.452，P均＜0.01。結(jié)論α硫辛酸能夠明顯提高AD大鼠的學習記憶和空間探索能力;其機制可能為活化PKA-CREB信號通路，提高PKAⅡα、p-CREB蛋白表達。

關(guān)鍵詞:阿爾茨海默病;蛋白激酶A; cAMP反應元件結(jié)合蛋白;α硫辛酸;大鼠

阿爾茨海默病(AD)是目前神經(jīng)退行性疾病及癡呆的最常見原因，其發(fā)病機制仍不明確。AD特征性的病理改變是在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域的細胞外出現(xiàn)以β-淀粉樣蛋白(Aβ)為核心的老年斑、細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及選擇性的神經(jīng)元缺失。α硫辛酸(α-LA)是一種獨特的氧化-還原雙向的氧化應激強效抑制劑，主要通過清除自由基，螯合金屬離子，再生其他抗氧化劑和修復氧化損傷而發(fā)揮抗氧化作用［1］。2012年2月～2013年1月，我們觀察了α硫辛酸對AD模型大鼠海馬組織蛋白激酶A(PKA)、cAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)表達的影響，探討α硫辛酸的腦保護作用及其機制，為其臨床治療AD提供可能的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠24只，4個月齡，體質(zhì)量(200±34)g，由河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心提供，飼養(yǎng)于標準實驗環(huán)境中，自由攝取飲食。大鼠立體定位儀(日本東京成茂科學器械研究所)，水迷宮(北京新天地公司)，紅外線掃描儀(Odyssey Li-cor Gene公司)，Aβ1-42(Sigma公司)，PKA Ⅱα試劑盒(Santa公司)，p-CREB試劑盒(CS T公司)，α硫辛酸(Sigma公司)。

1.2模型制作與干預按隨機數(shù)字表將24只大鼠分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組和α硫辛酸組各6只。行水迷宮訓練3天后，模型組和α硫辛酸組制作AD模型［2］: 10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉。將大鼠固定于腦立體定位儀上，選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)，于前囟向后4.5mm，中線旁開2mm處，鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自腦表面垂直進針2mm，將5 μL聚集態(tài)1 μg/ μL Aβ1-42溶液緩慢注入，留針10min，使Aβ1-42充分浸潤局部組織，緩慢撤針，用骨蠟封閉顱骨創(chuàng)口，縫合切口。正常對照組不予處理，假手術(shù)組注入等體積生理鹽水。造模后24 h，α硫辛酸組腹腔注射α硫辛酸100mg/(kg·d)，正常對照組、假手術(shù)組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，共21天。

1.3相關(guān)指標觀察

1.3.1學習記憶能力測試藥物干預后各組均采用Morris水迷宮行定位航行試驗和空間探索試驗［2］。①定位航行試驗:將大鼠面向池壁分別從四個入水點放入水中，2min內(nèi)尋找到平臺的時間即為逃避潛伏期。若2min內(nèi)未找到平臺，則用手牽引幫助其至平臺上并停留10 s，其逃避潛伏期為2min。每次訓練間隔60 s，連續(xù)測試5天，每天上下午各2次。②空間探索試驗:測試第6天撤除平臺，將大鼠從入水點放入水中，記錄其2min內(nèi)穿越原來平臺位置的次數(shù)。

1.3.2海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達檢測

采用Western blotting法。學習記憶能力測試后麻醉大鼠迅速斷頭取腦，分離出海馬組織(冰上操作)，立即置液氮中保存。取50mg海馬組織，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入裂解液500 μL，蛋白磷酸酶抑制劑混合物5 μL，采用超聲勻漿器破碎組織;離心，取上清作為待分析的樣品。用BCA法［3］測定蛋白濃度。取含60 μg蛋白質(zhì)的樣品經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)到PVDF膜，室溫封閉1 h，與PKAⅡα、p-CREB抗體進行雜交，4℃過夜，用TBST洗膜3次，與二抗辣根酶標記的羊抗兔IgG和GAPDH進行雜交，避光置于搖床，室溫下孵育1 h，TBST洗二抗，4次，應用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測PKAⅡα和p-CREB蛋白表達。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料檢驗正態(tài)分布后，以珋x±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間比較用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組學習記憶能力

2.1.1定位航行試驗模型組逃避潛伏期第1～5天下降不明顯，余各組均有明顯下降趨勢。模型組逃避潛伏期明顯長于正常對照組及假手術(shù)組(P＜0.01)，且隨著訓練天數(shù)的增加，這種差異表現(xiàn)得更為明顯;α硫辛酸組逃避潛伏期明顯短于模型組，但均高于正常對照組與假手術(shù)組(P均＜0.01);假手術(shù)組與正常對照組避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);見表1。

表1　各組逃避潛伏期比較(s，)

表1　各組逃避潛伏期比較(s，)

注:與假手術(shù)組及正常對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01。

組別　n　　第1天　　第2天　　第3天　　第4天　　第5天正常對照組　6　69.92±3.97　60.67±1.50　50.83±3.54　41.25±3.08　30.92±3.68假手術(shù)組　6　71.75±3.19　63.33±4.76　53.17±3.93　42.50±3.71　30.42±2.47模型組　6　80.67±4.48*　78.92±4.08*　77.83±3.01*　77.00±3.52*　76.08±3.94*α硫辛酸組　6　75.67±3.96* #　72.08±3.40* #　66.08±3.18* #　60.75±3.16* #　51.50±4.29*#

2.1.2空間探索試驗正常對照組、假手術(shù)組、模型組、α硫辛酸組2min內(nèi)跨越平臺的次數(shù)分別為(16.25±3.48)次、(14.75±2.99)次、(5.88± 1.83)次和(9.54±3.09)次，模型組跨越平臺的次數(shù)明顯少于假手術(shù)組及正常對照組(P＜0.01)，α硫辛酸組跨越平臺次數(shù)明顯多于模型組，但少于少于假手術(shù)組及正常對照組(P均＜0.01)。

2.2各組海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達與正常對照組和假手術(shù)組比較，模型組海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達明顯降低(P均＜0.01);與模型組比較，α硫辛酸組海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達明顯增多(P均＜0.01)。見表2、圖1、圖2。

表2　各組海馬組織PKAⅡα和p-CREB蛋白表達比較(相對表達量，)

表2　各組海馬組織PKAⅡα和p-CREB蛋白表達比較(相對表達量，)

注:與正常對照組及假手術(shù)組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01。

組別　n　PKAⅡαp-CREB正常對照組6　0.910±0.263　0.523±0.526假手術(shù)組　6　0.898±0.279　0.503±0.267模型組　6　0.520±0.462*　0.219±0.452*α硫辛酸組　6　0.739±0.417* #　0.380±0.330*#

3　討論

研究證實，Aβ沉積于細胞外所致的神經(jīng)毒性作用是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素［3］。Aβ導致的炎癥反應和氧化應激及誘發(fā)神經(jīng)細胞變性和凋亡是AD患者認知機能障礙的主要原因［4］。采用Morris水迷宮行為學方法，測定各組學習記憶能力。模型組平均逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組及正常對照組，跨越平臺次數(shù)明顯減少，提示大鼠出現(xiàn)顯著的學習和記憶功能障礙。

圖1　各組海馬組織PKAⅡα蛋白表達

圖2　各組海馬組織p-CREB蛋白表達

CREB是多種蛋白激酶的磷酸化底物。因其能刺激基因轉(zhuǎn)錄，故又稱為“轉(zhuǎn)錄增強因子”。PKA是

最早被確認，也是最重要的蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)，長時性記憶需要新蛋白質(zhì)的合成［5］，而PKA-CREB信號通路在新蛋白質(zhì)的合成過程中發(fā)揮重要作用［6］。其中CREB的活化是學習記憶的分子標志，能夠促進長時性記憶的形成［7～9］。活化的PKA能夠使CREB的Ser133磷酸化，從而引起其分子構(gòu)像的變化，刺激了CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性，促進學習記憶基因被大量轉(zhuǎn)錄，并進一步影響促進與學習記憶相關(guān)的新蛋白質(zhì)合成。在這些新蛋白質(zhì)中包括大量與長時性記憶相關(guān)的因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、即刻早期基因產(chǎn)物c-Fos、神經(jīng)營養(yǎng)因子、Bcl-2蛋白等，均參與學習記憶的形成和維持。實驗證明，Aβ能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶的活化，使細胞內(nèi)cAMP水平降低，致使PKA失活，最終使CREB不能磷酸化而抑制LTM的形成［10］。Takeo等［11］報道PKA抑制劑的使用可明顯阻礙長期記憶的形成。本研究結(jié)果顯示，模型組海馬PKAⅡα及p-CREB蛋白表達水平明顯低于正常對照組和假手術(shù)組，提示其海馬PKACREB信號轉(zhuǎn)導通路的活動受抑制，損害了大鼠的記憶學習能力。

許多學者認為，氧化應激在AD發(fā)生的過程中起重要作用，研究顯示Aβ可誘導神經(jīng)細胞生產(chǎn)氧自由基，認為Aβ的神經(jīng)毒作用部分是由自由基介導的［12］。α硫辛酸是已知天然抗氧化劑中效果最強的，被譽為“萬能抗氧化劑”。α硫辛酸的抗氧化性主要表現(xiàn)在清除活性氧自由基、螯合金屬離子、再生內(nèi)源性抗氧化劑及修復氧化損傷細胞等方面。Kenjiro等［13］研究發(fā)現(xiàn)，α硫辛酸能夠在體外能抑制Aβ蛋白聚集，減少Aβ的形成，還能夠使已經(jīng)聚集的Aβ降解。魏文青等［14］對β淀粉樣蛋白誘導的PC12細胞的研究也表明，α硫辛酸可拮抗Aβ1-42誘導的細胞損傷，對神經(jīng)細胞具有一定的保護作用。對一些轉(zhuǎn)基因AD模型大鼠的研究也表明，大鼠α硫辛酸干預后學習和記憶能力明顯增強［15］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，α硫辛酸組學習記憶能力明顯好于模型組，海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白水平表達明顯高于模型組，證實α硫辛酸的神經(jīng)保護作用確切，其作用可能是通過PKA-CREB信號通路的活化來實現(xiàn)的。

綜上所述，α硫辛酸能夠抑制Aβ對海馬神經(jīng)細胞的損害，提高AD模型大鼠的學習記憶能力。其作用機制可能是上調(diào)PKA、CREB的表達。

參考文獻:

［1］Smith AR，Shenvi SV，Widlanskym，et al.Lipoic acid as a potential therapy for chronicdisease associated with oxidative stress ［J］.Currmed Chem，2004，11(9): 1135-1146.

［2］Giovannelli L，Casamenti F，Scali C，et al.Differential effects of amyloid peptides beta-(1-40)and beta-(25-35)injections into the rat nucleus basalis［J］.Neuroscience，1995，66(4): 781-792.

［3］Bayer TA，Wirths O，Majtenyik，et al.Key factors in Alzheimer'sdisease: beta-amyloid precursor protein processing，metabolism and intraneuronaltransport［J］.Brain Pathol，2003，11(1): 1-5.

［4］劉輝，陳俊拋，田時雨，等.Aβ1-40海馬注射對大鼠腦內(nèi)一氧化氮合酶表達的影響［J］.中華神經(jīng)科雜志，2001，34(2): 92-95.

［5］Cooke SF，Bliss TV.The genetic enhancement ofmemory［J］.Cellmol Life Sci，2003，60(1): 1-5.

［6］Nguyen PV，Woo NH.Regulation of hippocampal synaptic plasticity by cyclic AMP-dependent protein kinases［J］.Neurobiology，2003，71(6): 401-437.

［7］Brightwell JJ，Smith CA，Countryman RA，et al.Hippocampal over expression ofmutant creb blocks long-term，but not short-termmemory for a socially acquired food preference［J］.Learnmem，2005，12(1): 12-17.

［8］Brightwell JJ，Smith CA，Neve RL，et al.Long-termmemory for Place learning is facilitated by expression of cAMP response element-binding protein in thedorsal hippocampus［J］.Learnmem，2007，14(3): 195-199.

［9］Countryman RA，Gold PE.Rapid forgetting of social transmission of food preferences in aged rats: Relationship to hippocampal CREB activation［J］.Learnmem，2007，14(5): 350-358.

［10］Vitolo OV，Sant-Angelo A，Costanzo V，et al.Amyloid beta-peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility bydrugs that enhance AMP signaling［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(20): 13217-13221.

［11］Takeo S，Niimuram，Miyake-Takagi K，et al.A possiblemechanism for improvement by a cognition-enchanter nefiracetam of spatialmemory function and cAMP-mediated signal transduction system in sustained cerebral ischaernia in rat［J］.Br J Pharmacol，2003，138(4): 642-654.

［12］Gella A，Durany N.Oxidative stress in Alzheimerdisease［J］.Cell Adhmigr，2009，3(1): 88-93.

［13］Kenjiro O，Mie H，Masahito Y.Alpha-lipoic acid exhibits antiamyloid fibrils in vitro［J］.BBRC，2006，341(4): 1046-1052.

［14］魏文青，劉晶，張艷，等.α硫辛酸對β淀粉樣蛋白誘導的PC12細胞損傷的保護作用［J］.中國新藥雜志，2009，18(21): 2065-2067.

［15］Farr SA，Price TO，Banks WA，et al.Effect of Alpha-lipoic acid onmemory，oxidation，and lifespan in SAMP8mice［J］.J Alzheimersdis，2012，32(2): 447-455.

·臨床研究·

收稿日期:( 2014-12-29)

文章編號:1002-266X(2015)36-0029-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R741

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.010