乳腺干細胞及其對乳腺再生和癌變作用研究

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金面上項目(2011211A069); 新疆醫科大學第一附屬醫院院內自然科學基金青年項目(2013ZRQN50)

作者簡介：郭晨明(1980-)，男，碩士，主治醫師，研究方向：乳腺癌早期診斷與治療。

通信作者：郭麗英，女，碩士，主任醫師，博士生導師，研究方向：乳腺疾病,E-mail ：ggs318@126.com。

·綜述·

乳腺干細胞及其對乳腺再生和癌變作用研究

郭晨明1, 畢曉娟2綜述郭麗英1審校

(新疆醫科大學第一附屬醫院1消化血管中心乳腺外科,2臨床研究院干細胞研究中心， 烏魯木齊830054)

中圖分類號：R655.7

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.033

干細胞是一類存在于生物體中、用于維持組織與器官再生或損傷后修復的原始細胞[1]。雖然其分化增殖的速度較慢，但有能夠向多種組織分化的潛能[2]。目前在醫學發展的各個領域，干細胞都生占有一席之地，關于乳腺干細胞(MSCs)及乳腺癌干細胞的識別、干細胞在乳腺組織中的微環境調控以及在再生醫學中的作用，逐漸成為學者們關注和研究的焦點[3-5]。本文就乳腺干細胞及其與乳腺再生乳腺癌關系的作用作一綜述。

1干細胞與乳腺

干細胞按其來源可分為胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)與成體干細胞(adult stem cell，ASC)，在胚胎時期及胎兒時期組織中起源的被稱為胚胎干細胞，在出生后的個體組織中提取的為成體干細胞。目前由于存在倫理的問題，ESC的應用比較受限，并且技術相對而言不太成熟，而ASC則有著來源豐富、易于擴增、安全性高、不涉及倫理問題等優勢，在臨床上廣泛應用[6]。

哺乳動物的乳腺是一種由乳腺導管及乳腺小葉構成的具有乳汁分泌功能的復管泡狀腺；在哺乳動物出生后，乳腺可以多次重復再生，并且是體內唯一具有此項能力的器官。乳腺的發育可分為3個部分：胚胎期、青春期及妊娠期。在胚胎期發育中，已形成初級的乳腺導管，也稱為原基上皮芽[7]。其后乳腺一直停止生長，從青春期開始，原基上皮芽逐漸發育延生，最終形成上皮增生活躍的球形杵狀結構，成為終末芽胚(terminal end buds，TEBs)。TEBs由多層體細胞(body cell)構成內部，單層的帽細胞(cap cell)構成其外部，帽細胞的細胞分裂及分化能力很強[8]。細胞繼續增殖分化，到青春期末期時，發育為終末導管小葉單位(TDLU) ，形成一個完整的導管系統。人的乳腺上皮在纖維脂肪結締組織之中，而在小鼠體內，乳腺上皮是單純存在脂肪中。在人和小鼠乳腺中，包含2種不同類型的細胞系，分別為肌上皮細胞與管腔細胞，但相似之處在于這2種細胞系，都將分化形成導管細胞及泌乳細胞。方形或柱狀腔上皮細胞，排列在導管或小葉腔，在哺乳期是與乳汁的分泌有關的[9]。

自20世紀50年代起，已先后有科學家們通過分離小鼠乳腺上皮、細胞克隆、細胞移植等實驗對乳腺的再生進行研究。研究者驚奇地發現，在小鼠乳腺發育的階段內任意時段，取一定的組織進行培養移植，都能生成擁有完全再生能力的細胞，這是MSCs第一次進入研究者的視線。其后許多研究證明，從小鼠體內分離出的MSCs，在進行克隆并移植后，能夠再生出完整的小鼠乳腺腺體。而其中克隆化MSCs占乳腺上皮細胞的千分之一[10-13]。Van Keymeulen等[14]進行的小鼠實驗研究發現，其可增殖分化并生成不同的乳腺細胞系；研究發現在上皮內的2種細胞系中有1種單能干細胞，并能長期存活，這些細胞有強大的擴增能力。這一研究不僅在再生領域有很大的意義，而且還可以大膽猜測乳腺癌的不同亞型是否為干細胞所致。

2乳腺干細胞(MSCs)的識別與分離培養

正常的乳腺干細胞(MSCs)可處于未分裂靜息狀態，目前研究用于識別乳腺干細胞(MSCs)的方法主要有表型標記、DNA標記、超微分析、乙酰脫氫酶(ALDH) 等等。

2.1表型標記表型標記即為細胞表面標記早期常用的標記物多為Hoe-chest染色、SCA1、BrdU標志與雌激素受體等[15]。但這些因子在識別的特異性與靈敏性上，都或多或少存在一定的問題。近年來的研究發現了幾個更有效的細胞表面標記物，促進對乳腺干細胞的研究。

2.1.1CD49f、CD29與CD24CD24是可表達乳腺干細胞并用作于標記物的干細胞。從小鼠乳腺的組織中分離出的Lin+-CD24++CD29high細胞群，具有雙向分化的能力。實驗發現其能產生上皮細胞，內含有乳腺干細胞(MSCs)[16]。而在分離培養時剔除其余組織細胞的標志物后，單個Lin+-CD24++CD29high細胞同樣分化成乳腺組織，也證實了乳腺干細胞存在于這種細胞亞群中的觀點。

2.1.2Prominin-1此為是一種跨膜蛋白，在各種組織如血液、神經上皮細胞、人和小鼠胚胎和許多癌癥中，被常規作為標記物用以分離干細胞。

2.1.3Musashi-1Musashi-1是Musashi家族中的一員，在乳腺干細胞(MSCs)中有強表達[17]。此外，Kagara等[18]研究也證實了在Musashi-1基因的誘導下，腫瘤轉移性及耐藥性提高，嚴重影響預后，因此還可能是一個腫瘤干細胞的標志物。

2.2DNA標記許多研究發現，將標記的DNA合成物前體注入小鼠體內后，其DNA能夠長時間保持能被追蹤識別的狀態。間斷注射還能夠辨別初代的干細胞與后代細胞。

2.3電鏡下超微分析早在1997年，科學家通過電鏡觀察嚙齒類乳腺上皮的超微結構，發現有5種不同類型的細胞，而其中的小亮細胞則被被認為是干細胞和I級祖細胞[19]。

在2002年，研究人員首次使用蛋白Sca-l標記乳腺干細胞(MSCs)，分選出小鼠乳腺干細胞，并且研究了其特性與分化潛能。實驗結果表明，在青春期的小鼠乳腺的末端芽部位大量地表達Sca-1，Sca-1陽性細胞富含乳腺重建單位(mammary repopulating units, MRU)；將其按照一定比例稀釋后注射到清除了腺上皮的小鼠乳脂墊中可再生乳腺[20]。目前分離技術主要是免疫磁珠分選法(MACS)及流式細胞儀分選法(FACS)。乳腺干細胞(MSCs)的培養大多是通過黏附性表面的細胞貼壁進行的單層細胞培養，而Dontu等[19]將整形手術中切除的乳腺組織分離出上皮細胞，使用無血清培養基懸浮培養，即可繁殖形成多細胞球，即乳腺球。通過培養乳腺球，成功實現了體外研究乳腺干細胞。在有生長因子存在的非黏附性表面培養時，人類乳腺上皮細胞形成了球形群體，并證明了具有干細胞功能特性的細胞更易形成這種球形群體。乳腺球與神經球在結構上有一定的相似性，其具有自我更新能力。乳腺球的啟始細胞可能為乳腺干細胞，在這個培養的基礎上，成功建立了一種適合檢驗的細胞的自我更新和分化的體外含量測定方法，其分離出的細胞，在多次傳代之后，仍能夠保持未分化的狀態。因此，為乳腺的研究新領域。

3乳腺干細胞(MSCs)與乳腺再生

理論上來說，每個乳腺干細胞(MSCs)均可發育為一個完整的乳腺組織。哺乳動物的乳腺在妊娠期前后可發生反復再生與退化，是哺乳動物出生后，唯一一個可重復再生的器官。因而如何提取并應用乳腺干細胞(MSCs)，達到人體乳腺的修復、重建與再生，是目前乳腺干細胞(MSCs)的研究關注焦點。再生醫學的核心問題在于如何獲得“多能干細胞”。2012年的諾貝爾獎得主約翰·戈登與山中伸彌的研究方向就是動物克隆與干細胞生成，并發表了關于誘導多能干細胞的論文[21]。

乳腺的再生需要適宜的微環境，即乳腺干細胞龕[22]。微環境在不同的組織中有不同的條件，乳腺的微環境在不同時期中，既能支持乳腺干細胞(MSCs)的自我更新分裂，也能促進乳腺小葉、導管的形成，同時也能夠阻止乳腺干細胞的分化。有研究表明，干細胞微環境由3個方面組成，分別為干細胞、信號細胞及特異性細胞外基質。將源自乳腺的散在上皮細胞移植時，乳腺可以再生，這也能夠證實完整的微環境也能促進乳腺的再生[23]。微環境對于乳腺干細胞(MSCs)的調控有4條途徑：(1)壁龕內存在很多分泌因子，這些因子圍繞在干細胞周圍，參與了微環境的形成，分泌因子的穩定也有助于維持干細胞的穩定；(2)除分泌因子外，還需要完整的膜蛋白介導下的細胞與細胞之間信號的傳遞；(3)細胞外基質蛋白與整合素；(4)各種信號通路，如Wnt信號、Hedgehog信號等，均可在不同步驟影響干細胞的發育與分化。

4乳腺干細胞與乳腺癌變

自20世紀中期起，多發性骨髓瘤及白血病的相關研究第一次證實了癌干細胞的存在,其后發現的各種實體瘤中就包括乳腺癌的癌干/祖細胞。目前認為其來源可能有2個：正常干細胞發生癌性轉化和分化后的細胞獲得自我更新。細胞發生惡變是由于遺傳轉化及克隆與選擇所致,是累計的過程，并非是單獨某次改變能夠產生的結果。因此，持續分裂的細胞才能最終產生惡性轉化克隆[22-24]。

目前對于乳腺癌干細胞的應用主要集中在治療:(1)誘導乳腺癌干細胞的分化。由于乳腺癌干細胞對很多化療藥物耐受，故誘導分化后可以使化療敏感性提高[25]；(2)消除乳腺癌干細胞。通過實驗尋找相應的干細胞靶點，用于針對靶向治療[25]。(3)免疫介導殺傷乳腺癌干細胞。 Mine等[26]發現通過免疫系統，可以有效地識別并消除腫瘤，對處于靜止期的乳腺癌干細胞可能有效。

5現狀與展望

目前，對于乳腺干細胞(MSCs)的研究已取得了一定的成果。但特異性的乳腺干細胞(MSCs)標記物仍需不斷地研究，且在再生領域也鮮有再生正常乳腺的病例。對乳腺干細胞(MSCs)標記物及對乳腺再生的研究，將有助于認識正常乳腺的發育，與研究乳腺干細胞(MSCs)在乳腺癌發生中能夠產生何種作用，可進一步研究乳腺干細胞(MSCs)信號轉導的調控機制，從基因、分子水平理解乳腺癌的發生、發展關鍵調控點，并為乳腺癌的靶向治療及術后整形帶來了新的思路。應用乳腺成體干細胞長出的乳腺組織可用于乳房切除術后的乳房1、2期再造手術或隆胸手術，對乳腺癌患者或者其他相關疾病的患者，都有著十分廣闊的應用前景。

參考文獻:

[1]Han JS, Crowe DL. Tumor initiating cancer stem cells from human breast cancer cell lines[J]. Int J Oncol,2009, 34(5):1449-1453.

[3]Vermeulen L, Sprick MR, Kemper K, et al. Cancer stem cells-old concepts, new insights[J]. Cell Death Differ, 2008, 15(6):947-958.

[4]Santisteban M, Reiman JM, Asiedu MK, et al. Immune-induced epithelial to mesenchymal transition in vivo generates breast cancer stem cells[J]. Cancer Res,2009, 69(7):2887-2895.

[5]Morel AP, Lièvre M, Thomas C, et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition[J]. PloS One,2008, 3(8):e2888.

[6]Gangemi R, Paleari L, Orengo AM, et al. Cancer stem cells:a new paradigm for understanding tumor growth and progression and drug resistance[J]. Curr Med Chem, 2009, 16(14):1688-1703.

[7]Hardy KM, Booth BW, Hendrix MJC, et al. ErbB/EGF signaling and EMT in mammary development and breast cancer[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia,2010, 15(2):191-199.

[8]Watson CJ, Khaled WT. Mammary development in the embryo and adult:a journey of morphogenesis and commitment[J]. Development, 2008, 135(6):995-1003.

[9]Smalley MJ. Isolation. Mouse Cell Culture[J]. Humana Press,2010:139-170.

[10]Fridriksdottir AJR, Petersen OW, Rnnov-Jessen L. Mammary gland stem cells:current status and future challenges[J]. Int J Dev Biol,2011, 55:719-729.

[11]李連宏, 王喜梅, 謝豐培, 等. 乳腺干細胞調控與癌變[M]. 北京:人民衛生出版社, 2009:8-11.

[12]Petersen OW, Polyak K. Stem cells in the human breast[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol,2010, 2(5):a003160.

[13]Raouf A, Sun Y, Chatterjee S, et al. The biology of human breast epithelial progenitors[J] Semin Cell Dev Biol,2012, 23(5):606-612.

[14]Van Keymeulen A, Rocha AS, Ousset M, et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance[J]. Nature,2011, 479(7372):189-193.

[15]Shackleton M, Vaillant F, Simpson KJ, et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell[J]. Nature, 2006, 439(7072):84-88.

[16]Visvader JE, Lindeman GJ. Mammary stem cells and mammopoiesis[J]. Cancer Res,2006, 66(20):9798-9801.

[17]Wang XY, Penalva LO, Yuan H, et al. Musashi1 regulates breast tumor cell proliferation and is a prognostic indicator of poor survival[J]. Mol Cancer,2010, 9:221.

[18]Kagara N, Huynh KT, Kuo C, et al. Epigenetic regulation of cancer stem cell genes in triple-negative breast cancer[J]. Am J Pathol,2012, 181(1):257-267.

[19]Chepko G, Smith GH. Three division-competent, structurally-distinct cell populations contribute to murine mammary epithelial renewal[J]. Tissue Cell,1997, 29(2):239-253.

[20]Welm BE. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population[J]. Dev Biol,2002,245:42-56.

[19]Dontu G, Wicha MS. Survival of mammary stem cells in suspension culture:implications for stem cell biology and neoplasia[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia,2005, 10(1):75-86.

[21]Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell,2006, 126(4):663-676.

[22]Pavlovich AL, Manivannan S, Nelson CM. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules[J]. Tissue Eng Part A,2010, 16(12):3719-3726.

[23]Brisken C, Duss S. Stem cells and the stem cell niche in the breast:an integrated hormonal and developmental perspective[J]. Stem Cell Rev,2007, 3(2):147-156.

[24]Li RJ, Ying X, Zhang Y, et al. All-trans retinoic acid stealth liposomes prevent the relapse of breast cancer arising from the cancer stem cells[J]. J Control Release,2011, 149(3):281-291.

[25]Ting AH, McGarvey KM, Baylin SB. The cancer epigenome-components and functional correlates[J]. Genes Dev,2006, 20(23):3215-3231.

[26]Mine T, Matsueda S, Li Y, et al. Breast cancer cells expressing stem cell markers CD44+ CD24lo are eliminated by Numb-1 peptide-activated T cells[J]. Cancer Immunol,2009, 58(8):1185-1194.

[收稿日期:2014-09-13]

(本文編輯楊晨晨)