α-enolase蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達及其臨床意義

朱禮昆，楊蔚琪，楊 云

（昆明醫科大學第二附屬醫院 整形外科，云南 昆明 650032）

α-enolase（ENO1） 是烯醇化酶家族中3種同功酶之一，是一種多功能的蛋白，作為糖酵解過程中的關鍵酶，α-enolase廣泛分布在原核和真核細胞的細胞質中，其基因表達隨細胞病理生理、代謝、發育狀況的不同而改變[1]。Jiang等[2]通過構建結腸癌相關生物學網絡研究發現：α-enolase與細胞增殖、細胞凋亡、細胞分裂、細胞遷移、蛋白質水解等生物學過程相關聯，并且是結腸癌相關生物學網絡的中心基因之一，這提示α-enolase可能在腫瘤發生發展過程中發揮著重要的作用。口腔鱗狀細胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發病率位于口腔頜面部腫瘤的首位，并且近年來仍有上升趨勢。本研究通過測定α-enolase在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達，探討其與口腔鱗癌發生發展的關系，這對揭示口腔鱗狀細胞癌發生、發展的精確分子機制，設計合理的治療藥物及判斷預后，進一步提高我國口腔鱗狀細胞癌的治療水平具有重要意義。

材料和方法

一、一般資料 收集2010年1月-2012年10月昆明醫科大學第二附屬醫院整形外科術前未經任何治療的口腔鱗狀細胞癌蠟塊40例，其中男性24例，女性16例，平均年齡58.5歲，淋巴結轉移者12例，根據腫瘤分化程度分為低分化、中分化和高分化鱗癌，根據國際抗癌聯盟（UICC） 2002年口腔癌分期標準，包括I+II期25例，III+IV期15例。對照組10例，均為正常口腔黏膜組織。

二、主要實劑及儀器 ELISA試劑盒：北京鑫方程生物技術有限公司，產品編號FU-E10980。PCR儀：ABI儀器型號9700。基因組提取試劑盒：莊盟生物，產品編號ZP311 2X。SYBR MIX：莊盟生物，產品編號ZF101。

三、方法 1．ELISA定量測定α-enolase濃度：操作步驟參照文獻[3]。

2．利用real-time PCR測定α-enolase mRNA表達：用TRIzol法抽提總mRNA，測定其濃度和純度，用RT-PCR逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA后進行PCR擴增。α-enolase上游引物：5'-ATTGAGCTAGATGGGACCGAGAAT-3'，下游引物：5'-CACTGGGAGTATGAGGTCAGGGTT-3'，PCR產 物159bp；β-actin上游引物：5'-TCATGAAGTGTGACGTGGACA-3'，下 游 引 物： 5'-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3'，PCR 產 物158bp。PCR條 件：95℃預變性2min，95℃變性2s，59℃退火延伸30s，50個循環；72℃終延伸12s。

結 果

一、口腔鱗狀細胞癌中α-enolase蛋白的表達由附圖可見，口腔鱗狀細胞癌組織中α-enolase蛋白表達明顯高于正常粘膜組織（P＜0.05）；由表1可見：α-enolase蛋白在低、中、高分化口腔鱗狀細胞癌組織中表達均有差異（P＜0.05），差異具有統計學意義，高分化鱗癌的α-enolase濃度＞中分化鱗癌＞低分化鱗癌；有淋巴結轉移、TNM分期為III+IV期者α-enolase的表達分別明顯高于無淋巴結轉移、TNM分期為I+II期者（P＜0.05）。

二、口腔鱗狀細胞癌中α-enolase蛋白表達與臨床病理參數間的關系 由表2可見，α-enolase在口腔鱗狀細胞癌中的表達與淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤分化程度密切相關（P＜0.05），而與患者的年齡、性別無關（P＞0.05）。

附圖 口腔鱗狀細胞癌、正常粘膜組織中α-enolase蛋白結果比較

表1 口腔鱗狀細胞癌α-enolase濃度（±s,ng/ml）

表1 口腔鱗狀細胞癌α-enolase濃度（±s,ng/ml）

注：低分化鱗癌與中分化鱗癌比較▲P＜0.05；中分化鱗癌與高分化鱗癌比較△P＜0.05；低分化鱗癌與高分化鱗癌比較◇P＜0.05；淋巴結轉移與無淋巴結轉移比較●P＜0.05；III+IV期患者與I+II期比較☆P＜0.05。

組分 n淋巴結轉移 12無轉移 28 α-enolase濃度960.6±15.40 857.86±30.45●P 0.036低分化 16 839.28±17.49 0.029中分化 12 906.00±11.92▲ 0.032高分化 12 987.06±16.79△◇ 0.048 III+IV期 15 998.86±30.45☆ 0.021 I+II期 25 852.87±14.24

表2 口腔鱗狀細胞癌中α-enolase蛋白表達與臨床病理參數間的關系

討 論

烯醇化酶（enloase，ENO） 是糖酵解途徑中催化2-磷酸甘油酸轉變為磷酸醇式丙酮酸的酶，烯醇化酶家族包括α-enolase（ENO1）、β-enolase和γ-enolase。α-enolase作為一種糖酵解酶，廣泛分布在原核和真核細胞的細胞質中，是一個高度保守的胞漿酶類，由兩個含有433個氨基酸，分子量約47kDa的亞單位反向平行結合構成的二聚體，在細胞質中起催化作用，形成磷酸烯醇式丙酮酸[4]。在臨床上，γ-enolase已作為一種常用于指導小細胞肺癌患者的療效監測、復發預測和預后評估的血清腫瘤標志物。

以往認為糖酵解代謝酶的生物學活性只是催化能量代謝，然而Kim等[5]研究發現糖酵解酶都是具有多功能的蛋白，其所涉及的其他生物學功能與腫瘤的發生發展過程密切相關；最近研究發現，烯醇化酶是一種多功能蛋白，其多樣性主要體現在細胞定位和功能上[6]。位于細胞膜的α-enolase能促進腫瘤細胞侵襲和轉移，α-enolase蛋白的C端具有一個跨膜結構域（包含16個氨基酸），以此錨定于細胞膜[7]。Jiang及同事[2]通過構建結腸癌相關生物學網絡研究發現：α-enolase與細胞增殖、細胞凋亡、細胞分裂、細胞遷移、蛋白質水解等生物學過程相關聯，并且是結腸癌相關生物學網絡的中心基因之一，這提示α-enolase可能在腫瘤發生發展過程中發揮著重要的作用。

在臨床上，γ-enolase已作為一種用于指導小細胞肺癌患者的療效監測、復發預測和預后評估的血清腫瘤標志物。鑒于α-enolase與γ-enolase是同一家族，近年來越來越多的研究者開始關注α-enolase作為腫瘤標志物的潛能。目前在腫瘤組織中α-enolase的表達水平及其與患者臨床相關性尚無明確定論，有研究發現，在轉移性肺癌的肺泡Ⅱ型肺泡、小細胞肺癌、頭頸癌患者腫瘤組織中，α-enolase表達水平是上調[8-10]。2003年Chang及其同事研究發現，在非小細胞肺癌患者腫瘤組織中，α-enolase表達水平顯著下調，α-enolase表達水平與肺癌患者預后相關，其表達量越低，患者預后越差[11]，這提示α-enolase可能抑制腫瘤發生發展過程。然而更多研究表明，α-enolase與腫瘤發生發展存在正相關。α-enolase作為肺癌相關抗原，在非小細胞肺癌患者腫瘤組織和胸腔積液中的腫瘤細胞中高表達，其表達量越高，患者預后越差[12]；頭頸癌患者腫瘤組織中α-enolase顯著高于正常對照組，其表達量越高，患者預后越差[13]；乳腺癌患者腫瘤組織中α-enolase的mRNA水平顯著高于配對正常組織，并且這種改變在雌激素受體陽性（ER+） 的乳腺癌亞型中尤明顯，α-enolase表達水平越高，患者預后越差[14]。

口腔鱗狀細胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發病率位于口腔頜面部腫瘤的首位，并且近年來仍有上升趨勢。本研究通過ELISA法測定α-enolase在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達，結果發現：口腔鱗狀細胞癌組織中α-enolase蛋白表達明顯高于正常粘膜組織，α-enolase的高表達量與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期相關，隨著淋巴結轉移及腫瘤分化程度、TNM分期的增加，α-enolase的表達會增加，提示在口腔鱗狀細胞癌組織中α-enolase蛋白表達上調，α-enolase可能在口腔鱗狀細胞癌中的發生、發展起著重要作用，這與在其他腫瘤中的研究結論基本相-致[8-10]，但這些研究多以腫瘤組織與癌旁組織為標本，多應用免疫組化方法進行研究的，而我們的實驗是以腫瘤組織與正常人黏膜組織為標本，應用ELISA方法進行研究。總之，本研究雖然通過測定α-enolase在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達，探討其與口腔鱗癌發生發展的關系，發現α-enolase在口腔鱗狀細胞癌的發展過種中起著重要作用，但只是停留在分子表淺層面，對臨床診斷和治療能提供些參考和建議，究其根源需要在基因水平上明確α-enolase在肺腺癌組織中的表達情況，進一步明確α-enolase在口腔鱗狀細胞癌中所占居的重要地位，進而盡早明確是否可以應用于臨床診斷和治療。

［1］TERRIER B,DEGANDN,GUILPAINP,et al.Alpha-enolase:a target of antibodies in infectious and autoimmune diseases[J]．Autoimmun Rev,2007,6(3):176-182.

［2］JIANGW,LIX,RAOS,et al.Constructing disease-specific gene networks using pair-wise relevance metric:application to colon cancer identifies interleukin 8,desmin and enolase 1 asthecentral elements[J]．BMCSyst Biol,2008,2:72.

［3］KANEKON,GOTOH A,OKAMURA N,et al.Potential tumor markers of renal cell carcinoma:alpha-Enolase for postoperative follow up,and galectin-1 and galectin-3 for primary detection[J]．Int JUrol,2013,20(5):530-535.

［4］BAYSAL BE,FERRELL RE,WILLETT-BROZICK JE,et al.Mutations in SDHD,a mitochondrial complex II gene,in hereditary paraganglioma[J]．Science(80-),2000,287(5454):848-851.

［5］KIMJW,DANGCV.Multifaceted roles of glycolytic enzymes[J]．Trends Biochem Sci,2005,30(3):142-150.

［6］PANCHOLI V.Multifunctional alpha-enolase:its role in diseases[J]．Cell Mol Life Sci,2001,58(7):902-920.

［7］ARZA B,FELEZJ,LOPEZ-ALEMANY R,et al.Identification of an epitope of alpha-enolase(a candidate plasminogen receptor)by phage display[J]．Thromb Haemost,1997,78(3):1097.

［8］PEEBLESKA,DUNCAN MW,RUCH RJ,et al.Proteomic analysis of a neoplastic mouse lung epithelial cell line whose tumorigenicity has been abrogated by transfection with the gap junction structural gene for connexin 43,Gja1[J]．Carcinogenesis,2003,24(4):651-657.

［9］ZHANG L,CILLEY RE,CHINOY MR.Suppression subtractive hybridization to identify gene expressions in variant and classic small cell lung cancer cell lines[J]．JSurg Res,2000,93(1):108-119.

［10］WUW,TANGX,HUW,et al.Identification and validation of metastasis-associated proteins in head and neck cancer cell lines by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry[J]．Clin Exp Metastasis,2002,19(4):319-326.

［11］CHANGYS,WUW,WALSH G,et al.Enolase-alphais frequently down-regulated in non-small cell lung cancer and predicts aggressive biological behavior[J]．Clin Cancer Res,2003,9(10 Pt 1):3641-3644.

［12］CHANGGC,LIUKJ,HSIEH CL,et al.Identification of alpha-enolase as an autoantigen in lung cancer:its overexpression is associated with clinical outcomes[J]．Clin Cancer Res,2006,12(19):5746-5754.

［13］TSAIST,CHIEN IH,SHENWH,et al.ENO1,a potential prognostic head and neck cancer marker,promotes transformation partly via chemokine CCL20 induction[J]．Eur JCancer,2010,46(9):1712-1723.

［14］TUSH,CHANGCC,CHENCS,et al.Increased expression of enolase alpha in human breast cancer confers tamoxifen resistance in human breast cancer cells[J]．Breast Cancer Res Treat,2010,121(3):539-553.