基于線粒體16S rRNA基因序列的鱧屬魚類系統進化探討

2015-02-22 12:58:30朱樹人山東省淡水漁業研究院山東省淡水水產遺傳育種重點實驗室山東濟南250017上海海洋大學農業部淡水水產種質資源重點實驗室上海201306華東師范大學生命科學學院上海200241

長江大學學報(自科版) 2015年27期

朱樹人(山東省淡水漁業研究院，山東省淡水水產遺傳育種重點實驗室，山東濟南250017;上海海洋大學農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海201306；華東師范大學生命科學學院，上海200241)

孟慶磊，孫玉旋，張延華，朱永安(山東省淡水漁業研究院，山東省淡水水產遺傳育種重點實驗室，山東濟南250017)

孟慶磊，孫玉旋，張延華，朱永安(山東省淡水漁業研究院，山東省淡水水產遺傳育種重點實驗室，山東濟南250017)

[摘要]對4種鱧屬(Channa)魚類共108個個體的16SrRNA基因進行PCR擴增,經比對校正得到572bp(C.striata)和573bp(C.argus,C.maculata,C.asiatica)的基因片段,共檢測到10個單倍型,4種鱧所有單倍型之間共存在1個插入/缺失;此外有63個變異位點,其中簡約信息位點60個,序列表現出明顯的A偏倚;多態位點比例為11.2%;序列中轉換多于顛換,轉換/顛換之比為1.4。基于Kimu-ra雙參數法,計算的種間遺傳距離介于0.021[烏鱧(C.argus)與斑鱧(C.maculata)之間]到0.079[烏鱧(C.argus)與線鱧(C.striata)之間、斑鱧(C.maculata)與線鱧(C.striata)之間]。以非洲真副鱧(Parachannainsignis)為外群構建的NJ樹和ML樹中,線鱧位于進化樹的基部,表明線鱧是最早分化出來的種;進化樹顯示烏鱧和斑鱧親緣關系最近,表明2個種分化較晚。

[關鍵詞]線粒體DNA;16SrRNA;鱧屬;系統進化

鱧科魚類隸屬于鱸形目，僅包括鱧屬(Channa)和副鱧屬(Parachanna)2個屬。鱧屬有26個種，原產于亞洲，主要是東南亞；副鱧屬有3個種，來自熱帶非洲[1,2]。因其肉質鮮美、營養價值高，而且具有生肌補血、斂瘡生肌、促進傷口愈合等藥用價值，富含人體所需的鈣、磷、鐵、鋅等多種微量元素，深受廣大消費者的喜愛[3～5]。前人對鱧科魚類分類的研究偏重于形態比較方面[6]，然而形態特征容易受環境影響，且隨著更多的鱧科魚類被發現[7～9]，僅從形態特征對這些物種進行分類和親緣關系分析，會有一定的偏差。

與核DNA相比，線粒體DNA具有結構簡單、母系遺傳、進化速度較快、幾乎不發生重組等特點。因此作為一種重要的分子遺傳標記，廣泛應用于分子進化、物種鑒定、種群遺傳結構和系統發生研究中[10～12]。16S基因是線粒體DNA很重要的基因片段，易擴增并且序列比較保守，因此常用于物種鑒定及種群遺傳多樣性分析，在魚類研究中已經廣泛得到應用[13～15]。本研究通過對中國常見的4種鱧科魚類——烏鱧(C.argus)、斑鱧(C.maculata)、月鱧(C.asiatica)和線鱧(C.striata)的線粒體DNA 16S rRNA基因片段序列進行測定，對4種鱧科魚類的親緣關系進行分析，以期為鱧屬魚類的分子水平的系統學研究及種間雜交提供參考。

1材料與方法

1.1　材料

4種鱧屬魚類樣品于2013年5～10月份采集。烏鱧樣品采集于4個湖泊(鄱陽湖、洞庭湖、微山湖、太湖)和1個江域(錢塘江)，斑鱧樣品采自福建和廣東，月鱧和線鱧樣品都采自廣東。每個群體采集12尾。樣本均購自水上作業的漁民或附近的水產品市場，剪取少量胸鰭，保存于無水乙醇中，貼好標簽置于4℃冰箱備用。

1.2　DNA提取及PCR擴增

實驗前將胸鰭組織從酒精中取出，充分漂洗晾干并剪碎，采用標準的酚-氯仿法提取基因組DNA。提取的DNA取2μL用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并稀釋到合適濃度用于PCR擴增。

用于擴增線粒體DNA的16S rRNA 基因片段的引物序列為：16SA 5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3′[16]；16SB 5′-CCG GTT GAA CTC AGA TCA-3′[17]，引物合成時前面加M13接頭。

PCR反應體系為20μL，包括DNA 模板(100 ng/μL)1μL，2×Taq PCR MasterMix (天跟生化)10μL，(10μmol/L)和16SB(10μmol/L)各0.5μL,dd H2O 8μL。PCR擴增程序為：94℃預變性3 min，然后是35個循環，每個循環包括94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。

擴增產物經過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離后用EB染色并于凝膠成像儀上觀察，都能擴增出明顯單一亮度很亮的條帶，符合預期中的目的條帶，擴增產物送上海生工用M13F和M13R雙向測序。

1.3　數據分析

利用Clustal X(1.83)[18]對序列進行對位排列，并結合人工校正。通過MEGA5.0軟件[19，20]分析序列的堿基組成、變異位點，同時采用Kimura雙參數法計算種間的遺傳距離。設置非洲真副鱧(Parachannainsignis，AP006042)為外群參考，分別采用NJ法(Neighbor-joining)和ML法(Maximum Likehood)對序列數據進行分析，采用Kimura 2-parameter模型、Bootstrap置信值估算重復次數1000次，最后構建系統進化樹。

2結果與分析

2.1　16S rRNA PCR 擴增及序列分析

經PCR擴增，分別得到了4種鱧的16S rRNA基因片段擴增產物，得到序列大小為573bp(烏鱧、斑鱧、月鱧)和572bp(線鱧)。在所測得的108個序列中，共檢測到10個單倍型，已提交NCBI(KT358469-K358478)。其中，烏鱧4個單倍型(CA-H1，CA-H2，CA-H3，CA-H4)；斑鱧2個單倍型(CM-H1，CM-H2)；月鱧2個單倍型(CAS-H1，CAS-H2)；線鱧2個單倍型(CS-H1，CS-H2)。4種鱧所有單倍型之間共存在1個插入/缺失，此外有63個變異位點(圖1)，其中簡約信息位點60個，多態位點比例為11.2%。總體上看，序列中轉換多于顛換，轉換(si=16)/顛換(sv=11)之比為1.4，說明序列突變未達到飽和，各單倍型之間變異位點如圖2所示。在所有單倍型中，堿基A(30.2%)占最多，其余T、C、G分別占21.2%、25.9%和22.7%，其中A+T含量(51.4%)高于C+G含量(48.6%)(表1)。

僅列出變異點;H1~H4：單倍型;CA:烏鱧；CM:斑鱧；CAS：月鱧；CS：線鱧圖1　4種鱧基于線粒體16S rRNA基因的比對

圖2　4種鱧基于16S部分基因序列的NJ樹

表1　4種鱧線粒體16S rRNA片段堿基組成及單倍型

基于Kimura雙參數法，以轉換+顛換、轉換/顛換計算單倍型間的相對遺傳距離(表2)。K2P模型下顯示，4種鱧屬魚類種間差異(0.021～0.079)明顯大于種內差異(0.002～0.004)。種間最小遺傳距離位于烏鱧和斑鱧之間(0.021)，種間最大遺傳距離位于烏鱧與線鱧之間(0.079)、斑鱧與線鱧之間(0.079)。

表2　4種鱧基于部分16S基因序列在K2P模型下的遺傳距離

注：H1~H4、單倍型;CA、烏鱧；CM、斑鱧；CAS、月鱧；CS、線鱧

2.2　系統發育分析

圖3　4種鱧基于16S部分基因序列的ML樹

以非洲真副鱧為外群，采用MEGA5.0軟件構建了NJ和ML進化樹，結果分別見圖2和圖3。2種類型的系統進化樹獲得一致的拓撲結構，均支持烏鱧和斑鱧親緣關系最近，然后和月鱧聚為一支，線鱧位于進化樹的基部，是4種鱧屬魚類最早分化出來的種，最后與非洲真副鱧聚在一起。

3討論

基于16S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，目前普遍應用于魚類的分類鑒定。本研究在擴增16S rRNA時，在合成引物時加了M13接頭，與常用于COI部分基因擴增一樣[21,22]，測得的結果更準確。從108個樣品中僅獲得10個單倍型，每個物種的單倍型序列差異度最高為0.004，這跟每個群體取得的樣本數量有關，同時證實了16S rRNA基因在這4種鱧中同樣比較保守。研究中發現，4種堿基所占的百分含量在4種鱧16S rRNA擴增片段中相差不大；在所有單倍型中，堿基A(30.2%)占最多，A+T含量(51.4%)高于C+G含量(48.6%)，這與報道的其他鱸形目魚類16S rRNA基因的組成相似[23]。

NJ和ML構建進化樹的方法不一樣。NJ法運算速度快，但該算法每迭代運算一次只能夠搜索最近鄰居配對，對其他可能的配對不加以考慮，只能生成單一最優樹，這樣可能遺漏一些拓撲結構更合理的次優樹；而ML法是考慮了所有可能的途徑，能完全利用數據的系統發生信息[24]。在本研究中，不管采用NJ法還是ML法構建進化樹，都顯示4中鱧屬魚類中，首先聚在一起，烏鱧和斑鱧的親緣關系最近，這也說明烏鱧和斑鱧是4種中國鱧屬魚類最晚從一個物種分化出來的，表明烏鱧和斑鱧雜交的可交配性較高。Herbert等學者提出物種鑒定差異度臨界值為2%[25]，本研究中烏鱧和斑鱧的種間遺傳距離為0.021，微大于臨界值。從理論上講，有利于雜交鱧的形成。

本研究利用16S rRNA基因序列對4種鱧屬魚類進行了系統進化分析，從分子進化方面為4種鱧屬種間鑒定提供了基礎參考資料，也為種間雜交提供了依據。

[參考文獻]

[1]Li X,Musikasinthorn P,Kumazawa Y.Molecular phylogenetic analyses of snakeheads (Perciformes：Channidae) using mitochondrial DNA sequences [J].Ichthyol Res,2006,53：148～159.

[2]Vishwanath W,Geetakymari KH.Diagnosis and interrelationships of fishes of the genusChannaScopoli (Teleostei：Channidae) of northeastern India[J].Threatened Taxa,2009,1：97～105.

[3]Qin J,Fast A.Food selection and growth of young snakeheadChannastriatus[J].Appl Ichthyol,2007,1：21～25.

[4]Wee K L.Snakeheads-their biology and culture [M].Wee K L.Recent advances in aquaculture,London & Canberra：Croom Helm,1982:180～213.

[5]Sampath K,Pandian T.Interactions of feeding frequency and density on food utilization in air-breathing murrel,Channastriatus[J].Proc Indian Acad Sci,1984,93(5)：445～453.

[6]劉蘇,朱新平,陳昆慈.斑鱧、烏鱧及其雜交種形態差異分析 [J].華中農業大學學報(自然科學版),2011,30(4)：488~493.

[7]Musikasinthorn P.Channapanaw,a new channid fish from the Irrawaddy and Sittang River basins [J].Myanmar Ichthyol Res,1998,45：355～362.

[8]Musikasinthorn P.Channaaurantimaculata,a new channid fish from assam (Brahmaputra River basin),India,with designation of a neotype forC.amphibeus(McClelland,1845) [J].Ichthyol Res,47：27～37.

[9]Musikasinthorn P,Taki Y.Channa siamensis (Günther,1861),a junior synonym ofChannalucius(Cuvier in Cuvier and Valenciennes,1831) [J].Ichthyol Res,2001,48：319～324.

[10]Broughton R E,Milam J E,Roe B A.The complete sequence of the zebrafish (Daniorerio) mitochondrial genome and evolutionary patterns in vertebrate mitochondrial DNA [J].Genome Res,2001,11：1958～1967.

[11]Chang Y S,Huang F L,Lo T B.The complete nucleotide sequence and gene organization of carp (Cyprinuscarpio) mitochondrial genome [J].J Mol Evol,1994,38：138～155.

[12]Curole J P，Kocher T D.Mitogenomics：digging deeper with complete mitochondrial genomes [J].Trends Ecol Evol,1999,14：394～398.

[13]劉楚吾,徐田軍,劉麗,等.笛鯛屬 (Lutjanus) 魚類線粒體 16S rRNA [J].海洋與湖沼,2009,40(5)：563～571.

[14]畢瀟瀟,高天翔,肖永雙,等.4 種鱈魚線粒體 16S rRNA,COI 和 Cyt b 基因片段序列的比較研究 [J].南方水產科學，2009，5(3)：46～52.

[15]鄭文娟，朱世華，鄒記興，等.基于16S rRNA 部分序列探討12種鲹科魚類的分子系統進化關系 [J].水產學報，2009，32(6)：46～52.

[16]Simons C,Frati F,Beckenbach A,etal.Evolution,weighting,and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers [J].Ann Entomol Soc Am,1994,87：651～701.

[17]Kambhampati S,Smith P.PCR primers for the amplification of four insect mitochondrial gene fragments [J].Insect Mol Biol,1995,4：233～236.

[18]Thompson J D,Gibson T J,Plewniak F,etal.The CLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res,1997,5：4876～4882.

[19]Kimura M.A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences [J].J Mol Evol,1980,16：111～120.

[20]Tamura K,Peterson D,Peterson N,etal.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods [J].Mol Biol Evol,2011,28：2731～2739.

[21]Ward R D,Zemlak T S,Innes B H,etal.DNA barcoding Australia's fish species [J].Phil Trans R Soc B,2005,360：1847～1857.

[22]Ivanova N V,Zemlak T S,Hanner R H,etal.Universal primer cocktails for fish DNA barcoding [J].Mol Ecol Notes,2007,7：544～548.

[23]Marescalchi O.Karyotype and mitochondrial 16S gene characterizations in seven South American Cichlasomatini species (Perciformes,Cichlidae) [J].J Zool Syst Evol Res.2007,43(1)：22～28.

[24]李濤,賴旭龍,鐘揚.利用 DNA 序列構建系統樹的方法 [J].遺傳,2004,26(2)：205～210.

[25]Hebert P D,Ratnasingham S,deWaard J R.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species [J].Proceedings of Biological Sciences,2003,270 (Suppl)：S96～99.