Notch信號通路調控內皮細胞增殖與分化的研究現狀

羅甜 綜述，譚鋼 審校

（南華大學第一臨床學院，湖南衡陽421001）

Notch信號通路調控內皮細胞增殖與分化的研究現狀

羅甜 綜述，譚鋼 審校

（南華大學第一臨床學院，湖南衡陽421001）

內皮細胞；血管內皮生長因子類；Notch信號通路；綜述

Notch是一類進化上高度保守的跨膜蛋白家族，廣泛表達于各類細胞表面。Notch基因由Thomas Hunt Morgan首次在果蠅中發現并命名。Notch信號通路通過經典途徑或其他途徑被激活后，引發一系列分子反應，調控細胞的表型、增殖、分化、遷移及凋亡。目前對Notch的研究涉及神經干細胞、造血干細胞、心瓣膜及血管的形成、胚胎發育、腫瘤發生發展及人工組織工程等多個領域。血管組織工程及角膜組織工程是近期人工組織工程研究的熱點。相應的血管內皮及角膜內皮細胞系的構建是上述人工組織工程的關鍵。現就Notch信號通路調控內皮細胞增殖與分化的研究現狀作一綜述。

1 Notch信號通路

Notch信號傳導途徑在進化上是十分保守的，對胚胎發育至關重要。其通過短距離通訊調節細胞命運和干細胞的維持。此外，Notch信號途徑參與了許多生理和病理過程。異常Notch信號可以在不同的器官，如乳腺、腸和皮膚誘發腫瘤[1]。

在高等脊椎動物中，Notch的同系物已被鑒定，包括Notch1到Notch4（通常稱為Notch受體）。Notch1和Notch2彼此具有最高的同源性，而Notch3的和Notch4較Notch1和Notch2具有略微發散結構。Notch的胞內結構域是已知的轉錄激活因子，常常被稱為活化的Notch。Notch受體對應多種配體（Jagged1/Serrate1、Jagged2/ Serrate2、Delta1、Delta3和Delta4）。Delta1、Jagged1和Jagged2已被證實為Notch1、Notch2和Notch3的配體。普遍認為Jagged和Delta作為跨膜蛋白與表達于相鄰細胞表面的Notch受體相互作用[2]。

Notch信號傳導途徑調控多種細胞活動，包括分化、增殖、凋亡、細胞間黏附和遷移，甚至包括介導細胞間的相互作用。典型Notch途徑涉及細胞表面的Notch分子，其依次扮演一個受體和轉錄因子的角色。與相鄰細胞的配體結合啟動Notch受體一系列的蛋白水解反應，Notch受體經配體依賴性細胞外裂解，釋放胞外結構域，留下一端連于細胞內表面的胞內結構域。隨后胞內結構域由γ-secretase裂解，引起活化的Notch（Notch ICD或NICD）釋放進入細胞質。該過程可被γ-secretase抑制劑γ-分泌酶抑制劑（DAPT）阻斷。NICD轉位到細胞核，在那里與DNA結合蛋白CBF1（在哺乳動物中也被稱為RBPJk）交互作用并結合成的活化態的復合物，從而抑制或共激活各種譜系特異性基因的表達。該NICD/CBF1激活復合物中包括共激活因子Mastermind（在哺乳動物中被稱為MAML），是Notch靶基因轉錄的起始物[3]。Notch靶基因包括HES家族基因和HES相關基因Hesr1和Hesr2（也稱為Hey/Herp基因），其編碼的bHLH轉錄因子有促進祖細胞存活和抑制分化的作用[4]。在大多數生理和病理情況下，Notch信號的表達結果取決于量化參數。Notch靶基因的激活水平與信號的“強度”和相鄰細胞表面Notch受體-配體相互作用的動態變化密切相關。最新的基因和基因組的方法顯示的Notch信號可以通過大量基因的衰減和上述典型途徑被集成在一個復雜的基因電路中集中輸出[5]。Notch靶基因可被其他非典型的Notch信號傳導途徑調節，例如NICD，CSL，甚至Notch受體本身，具體而言，即血管內皮生長因子-A（VEGFA）/VEGFR-2途徑和Notch靶基因的獨立活化[6]。Notch信號通路既可以通過簡單的典型途徑激活，又有能力通過與其他途徑的結合激活。因此，Notch信號通路中靶基因的表達及該途徑中的其他步驟都應該被詳細研究以便全面地認識Notch依賴性機制。

2 Notch信號通路調控血管生成及內皮細胞

血管主要由血管內皮細胞、血管平滑肌細胞（SMC）及細胞外基質組成。血管的生成是指未分化的前體細胞在原位分化為內皮細胞，再組裝成無功能的血管迷路，原始血管網生長和重塑形成有正確結構血管網的過程[7]。

VEGF或VEGF-A強烈地促進血管生成，是血管發育不可或缺的元素。其結合了酪氨酸激酶受體VEGFR-1（Flt1）和VEGFR-2（Flk1），后者是在內皮細胞中產生血管內皮生長因子信號的初級受體[8-9]。VEGFR-1結合的VEGF-A的能力比VEGFR-2強，且VEGFR-1酪氨酸激酶很容易被激活，這使得活化的VEGFR-1以及其可溶形式sVEGFR-1成為內皮細胞VEGF的誘導劑，調節VEGFR-2的活化和血管芽的形成[10]。VEGFR-2全程參與了內皮細胞中VEGF-A的反應，即調節內皮細胞的生理狀態：增殖、遷移和血管形成。

VEGFR-3是VEGFR家族的第3個成員，僅在淋巴血管網形成過程中表達。該受體可被VEGF-C和VEGF-D激活。VEGF-C還可結合VEGFR-2使其蛋白水解，導致VEGFR-2/VEGFR-3的異二聚體的形成和活化[11-12]。但VEGF-C對VEGFR-3的親和力最強。VEGFR-3也調節血管生成，其缺失的小鼠原始血管叢形成過程中會產生嚴重的動脈-靜脈重塑缺陷導致小鼠死亡[13]。VEGF-C/ VEGFR-3被公認在淋巴血管網形成中的作用。VEGFC雙等位基因缺失的小鼠因淋巴血管無法形成在胚胎期即死亡。VEGFC雜合子的小鼠可順利長到成年，伴隨有淋巴管發育不全導致的淋巴水腫，但血管壁無明顯的缺陷[14-15]。

Notch信號通路不僅在細胞的分化、增殖、凋亡及免疫應答中發揮廣泛作用，也是血管新生的重要調控因素，并且通過調控血管內皮細胞的功能參與免疫應答和炎性反應等。Notch-1和Notch-4受體以及JAG-1、DLL-1、和Delta樣配體4（DLL-4）均在內皮細胞表達。只有受體與相應的配體相互作用才能保證內皮細胞系的正常形態和功能，例如DLL-4/Notch-1信號傳導途徑中，Notch-1或DLL-4任何一方的缺失都將導致嚴重的血管缺陷和胚胎死亡[16]。血管前端Notch信號正向感應的降低有利于內皮細胞保持對VEGF刺激的回應，也有利于維持末梢細胞的分裂活性及血管壁的延伸[15，17]。血管網各分叉處存在另一個Notch靶點，即Nrarp蛋白，該蛋白能拮抗Notch信號并在此作用點形成血管分支。Notch和VEGFR-1的上調會抑制Nrarp的表達，Nrarp的沉默將直接導致內皮細胞增殖減弱，從而使血管形成受阻，血管網密度降低。對已形成的血管也造成了致命打擊，血管網中可見到不完整的血管腔及原始血管[18]。

抗血管生成的DLL-4和促血管生成的Jagged-1共同調節Notch的激活，而Notch的激活水平將決定下一步是走VEGF/VEGFR途徑還是其他信號轉導途徑。所有這些通路的協同作用是脈管系統形成正確構型及保持穩定性的必要條件[19]。

隨后關于血管芽中Notch-VEGFR-2相互作用的研究顯示，在無VEGF-A/VEGFR-2信號表達的內皮細胞中檢測到了高度表達的DLL-4，表明此時的內皮細胞中也無Notch信號[18，20]。Notch信號調節并決定內皮細胞對VEGF-A的響應水平，以及VEGFR-2、VEGFR-3在內皮細胞中的表達。特異性缺失Notch和RBPJk的內皮細胞，強烈上調VEGFR-3蛋白，而不改變VEGFR-2的表達。該觀察證明，Notch能有效地抑制VEGFR-3的信號表達[21]。

血管的形成并不是一個持續的過程，最近有報告顯示，斑馬魚的孵化過程中晝夜節律控制著血管生成。晝夜節律調節器Bmal1直接作用于VEGF基因的啟動子區域引起VEGF-A的高度表達[19，20，22]。這些數據印證了之前的報告，在小鼠的腫瘤細胞中檢測到了VEGF-A的晝夜表達[19]。有趣的是，Notch信號也被這樣一種晝夜節律模式調節，受Notch和FGF/MAPK通路調節的基因HES7是這種生物鐘的重要組成部分[22]。在血管生成的節律性調控中是否存在Notch-VEGF-A的相互作用，目前鮮有相關報道。

上述報告的研究結果顯示，血管的正常生長需要VEGFR-2、VEGFR-3和Notch信號傳導途徑之間的相互作用。Notch調節VEGFR-2和VEGFR-3與血管生成的相關性。此外，VEGFR-2和Notch既能單獨調節VEGFR-3的表達，也能相互協同調節。VEGFR-3能在低活性的Notch信號，甚至在沒有VEGF配體和VEGFR-2信號的情況下調節內皮細胞的生長。此外，VEGFR-3可通過增強Notch信號介導的巨噬細胞源性VEGF-C的活化，在血管融合點促進細胞間的穩定性。因此，VEGFR-3似乎具有促進和抑制血管生成的雙重功能。這些發現引導作者去研究內皮細胞中不同程度的Notch活性所激活的不同信號通路。體外培養的血管內皮細胞組織及細胞相容性高，具有一定的生長性，如能有效地應用于臨床將有望解決有限的血管來源問題。

3 Notch信號通路調控角膜內皮細胞

角膜內皮由單層均勻大小的六角形細胞通過緊密連接形成。角膜內皮細胞完整地緊密連接和正常的細胞密度是維持角膜透明性及視覺的關鍵。由于缺乏有絲分裂刺激因子、細胞接觸抑制及房水中存在的抗促有絲分裂因子，成人角膜內皮細胞（CEC）是無有絲分裂活性的。當角膜內皮細胞損傷后，附近正常CEC擴大和遷移以填補因損傷造成的空缺，還有證據表明，CEC經過化學、機械或其他因素造成的損傷后可發生內皮間質化（EnMT），體外培養的內皮細胞也存在這種情況[23]。在此過程中，靜止的內皮細胞對促分裂因子的刺激產生了反應。這種變化包括細胞形態學特征的改變以及與α-平滑肌動蛋白（α-SMA）表達增加相關的膠原產生，最終形成肌成纖維細胞。此外，N-鈣粘蛋白表達的下調，伴隨著Ⅳ型膠原基底膜向Ⅰ型膠原纖維膜的轉換，從而產生不正常的纖維狀細胞外基質[24]。

體外培養的原代大鼠角膜內皮細胞中檢測到Notch相關的Jag-1、Jag-2、Notch-1、Notch-2、HES-1的mRNA的顯著表達，上述所有基因，特別是Jag-2在第3代至第5代角膜內皮細胞中仍保持較高水平[24]。α-SMA及同步出現HES-1的表達是EnMT進行的一個標志，表明EnMT和Notch信號通路激活之間存在關聯。加入Notch信號抑制劑DAPT后，Jag-1、Jag-2、Notch-1、Notch-2、HES-1及α-SMA的表達顯著下調，而Cx43、ZO-1及N-cadherin表達增加。形態學上則表現為加入DAPT的培養基中角膜內皮細胞大部分保持著最初的均勻六邊形形態，而未加DAPT的培養基中的角膜內皮細胞形態和體積均發生改變[25]。已有研究證實，轉化生長因子β（TGF-β）信號通路的活化能介導兔子角膜的EnMT，同樣的現象也在大鼠角膜中被證實，經TGF-β1/β2/β3處理的角膜內皮細胞長出偽足并被拉長，許多細胞喪失了縫隙連接。相反，在同時加入TGF-β及DAPT的培養基中內皮細胞仍維持著原代形態[26]。DAPT幾乎完全阻斷了TGF-β誘導的EnMT，證明Notch信號通路位于TGF-β信號的下游。傳代的內皮細胞通常比原代細胞顯示出更高的增殖和遷移活性。研究發現，DAPT應用降低了CEC的增殖率，并輕微抑制內皮細胞的遷移。有研究顯示，冷凍損傷的角膜局部應用DAPT后顯著減少角膜水腫，提高透明度[25，27]。這種結果可能是因為DAPT抑制了EnMT，從而保存了CEC較高的密度，促進了角膜內皮功能的恢復，這種現象有利于保護基質免于水腫混濁。

在其他細胞類型研究中所發現Notch信號和TGF-β相互作用引發多種反應。例如，TGF-β1誘導的Notch信號激活原代大鼠腹膜間皮細胞，DAPT抑制這種活化，通過抑制EnMT防止腹膜纖維化，TGF-β信號的激活還可以上調生肌細胞中HES-1的表達。被TGF-β激活的Notch也能活化和增強R-Smad蛋白的表達。這些途徑調控心臟內皮細胞增殖和分化。TGF-β和Notch信號傳導途徑協同調節以誘導肺泡上皮細胞、腎小管和皮膚表皮的間充質化[28-30]。TGF-β和Notch信號傳導途徑的串擾對EnMT控制也有一定作用。同樣，在胚胎心臟發育過程中，Notch信號促進TGF-β介導的EnMT，引起心臟瓣膜原基的細胞化[31]。

DAPT能抑制大鼠角膜內皮損傷修復過程中的纖維化，為人角膜內皮纖維化癥的治療提供了新靶點。也為治療EnMT相關的纖維化疾病指明了新方向。其他的研究正在計劃評估Notch抑制劑對人工內皮組織工程的益處。體外培養角膜組織的可用性可能通過抑制Notch信號，減少CEC的EnMT而增加。該方法也可以用于減少創傷眼角膜后纖維膜的形成。由于可供移植的角膜組織全球性短缺，上述結果具有潛在的臨床意義。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.023

:A

:1009-5519（2015）05-0702-04

2014-09-19）

羅甜（1989-），女，湖南常德人，在讀碩士研究生，主要從事眼科臨床工作；E-mail：413456890@qq.com。