利用轉基因家蠶絲腺生物反應器生產重組蛋白的應用前景

黃紹華，董久鳴，劉云財，占鵬飛

（1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.浙江省農業技術推廣中心，浙江杭州 310020；3.湖州市農業科學研究院，浙江湖州 313000）

利用轉基因家蠶絲腺生物反應器生產重組蛋白的應用前景

黃紹華1，董久鳴2，劉云財1，占鵬飛3

（1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.浙江省農業技術推廣中心，浙江杭州 310020；3.湖州市農業科學研究院，浙江湖州 313000）

家蠶絲腺擁有較強合成絲蛋白的能力，通過利用這一能力，使其能夠大量生產有價值的蛋白，人們開始引入轉基因家蠶，使它能夠在絲腺中合成重組蛋白并分泌到蠶繭中。獲得的重組蛋白可在生物學、生物技術，和藥學領域中得到廣泛應用。我們通過控制合成蛋白在絲腺中的定位，在后部絲腺（PSG）中表達重組蛋白使其定位在不能溶解的絲素中，在中部絲腺（MSG）中表達則定位于親水外層的絲膠層中。本文主要討論將轉基因家蠶絲腺生物反應器作為優良工具，應用于大量生產藥用蛋白和在工業化水平生產相關重組蛋白的可能性，以及生產重組蛋白過程中所面臨的挑戰和未來的應用前景。

家蠶；轉基因家蠶；絲腺生物反應器；重組蛋白

隨著社會的發展，生產重組蛋白的需求越來越高。重組蛋白質的生產一直是生物技術產業發展的一大瓶頸，盡管在幾乎所有的表達系統都得到了很大的發展，但目前對重組蛋白的大量需求來說，所能提供的重組蛋白產量是遠遠不夠的。

1 轉基因家蠶絲腺生物反應器的反應體系

在現行的標準化生產重組蛋白過程中，大腸桿菌表達系統是發展最早、使用最廣泛的表達系統，但其翻譯后修飾體系不完善，目的蛋白常以包涵體形式表達，產物的生物活性較低，純化困難；酵母表達系統表達的融合蛋白具有了不完全的糖基化修飾能力；哺乳動物細胞生物反應器主要利用中國倉鼠卵巢細胞（CHO）作為宿主，但培養CHO細胞的生物反應器建立和其運行成本極高。昆蟲桿狀病毒表達系統是真核表達系統，具有大多數真核生物相似的翻譯后修飾及轉移外源蛋白的能力，但不能表達完整N聚糖的糖蛋白。利用家蠶多角體病毒（BmNPV）作為載體建立了在家蠶中瞬時表達重組蛋白的系統［1，2］。在這個系統中，重組蛋白的表達僅局限在某一代中，要想表達重組蛋白，每一代必須感染家蠶多角體病毒。考慮到生產重組蛋白的經濟性，人們開始將目光投向發展轉基因生物作為宿主，包括哺乳動物、鳥、昆蟲和植物。

轉基因家蠶絲腺生物反應器是利用家蠶絲腺表達重組蛋白的轉基因動物表達系統。家蠶經過長達近五千年的人工馴養、選育，已喪失飛翔逃逸能力，是一種非常安全轉基因動物，不必擔心轉基因家蠶飛翔逃逸室外的風險；而在絲蛋白合成、分泌方面具有非常強的能力，在蠶5齡期的短短5～6 d時間里，絲腺體重可增加20多倍，合成絲蛋白質的量占整個蠶體蛋白質總量的70%以上，如此高效的蛋白質合成效率是目前已知其他生物反應器所不具備的；因此，轉基因家蠶絲腺生物反應器一旦構建成功，表達外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白純化方便，只需要通過飼養轉基因家蠶，就可以非常方便地維持表達系統的延續，是一種非常有價值的表達系統。1989年在擬尺蠖中發現了一個叫piggyBac的轉座子［3］，利用這個轉座子在家蠶中建立了生殖系轉基因技術，將插入外源基因的piggyBac的質粒載體和帶有piggyBac轉座基因的輔助載體，在前胚盤期注射到家蠶卵中［4］，利用標記基因篩選G1代轉基因家蠶，確立了比較全面的構建一種轉基因家絲腺生物反應器生產重組蛋白的新方法。近年來，家蠶轉基因技術有了較大的發展。從選擇不同蠶品種，不同蠶卵注射時間，報告基因的選擇，轉座子載體的選擇，轉基因家蠶載體中所用啟動子的選擇，到表達外源基因種類的選擇等都獲得重大進展［5，6］。

2 絲腺組織與重組蛋白表達

2.1 絲腺組織與絲蛋白合成

絲腺從形態和功能上分為三個不同的區域，后部絲腺（PSG），中部絲腺（MSG），和前部絲腺（ASG）。蠶絲蛋白主要由在后部絲腺合成的絲素和在中部絲腺合成的絲膠兩部分組成。絲素蛋白為非溶解性纖維狀蛋白，由重鏈（Fib-H），輕鏈（Fib-L），和糖蛋白（P25）以6∶6∶1的摩爾比組成；絲素蛋白在PSG中合成，分泌到PSG的內腔中，然后轉運到MSG的管腔中；之后絲素蛋白被的親水性絲膠蛋白包被，并被轉運到前部絲腺（ASG），家蠶通過“8”字形的頭部運動，將其拉出并在接觸空氣使之變硬。絲素和絲膠蛋白的質量比分別大約為75%和25%。家蠶絲腺具有高效合成絲蛋白質的能力，借助于絲蛋白啟動子的時空特異性，可在家蠶絲腺的特定組織位置大量表達目的蛋白，并利用吐絲結繭收集表達產物，通過轉基因技術將家蠶絲腺構建成高效表達外源蛋白質的生物反應器，成為利用家蠶生物反應器表達外源基因的首選。

我們可以通過控制重組蛋白在絲腺組織中的表達區域，間接控制重組蛋白在絲腺中的定位：在PSG中表達基因使重組蛋白定位于絲素，在MSG中表達基因則使重組蛋白定位于外層絲膠層。利用絲腺不同區域的特異性基因啟動子，設計并控制重組蛋白在絲腺組織中不同區域表達而達到融合于絲素或絲膠的目的。

2.2 利用后部絲腺表達重組蛋白

利用PSG表達重組蛋白的早期研究主要是以絲素基因Fib-H重鏈表達系統和Fib-L輕鏈表達系統在家蠶絲腺細胞中表達GFP基因，GFP蛋白能完整地分泌到絲腺中，說明絲腺細胞能夠完整地表達外源蛋白。Tomita等［7］通過構建編碼融合蛋白（絲素Fib-L蛋白，人類Ⅲ型膠原蛋白片段）的cDNA，以增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作標記，將Fib-L啟動子與piggyBac載體重組，利用顯微注射法注射到蠶卵中，處理后的轉基因家蠶PSG細胞合成重組蛋白，分泌到蠶繭中。融合蛋白C-末端的EGFP區域在分泌的過程中并沒有喪失熒光性，因此產生熒光蠶繭，在蠶繭中存在人類膠原蛋白序列也可以通過膠原蛋白酶切實驗和氨基酸測序證實。

Hino等［8］將含有Fib-L啟動子、人堿性成纖維細胞生長因子基因bFGF的piggyBac質粒導入蠶卵，在家蠶PSG中融合表達了人堿性成纖維細胞生長因子，融合蛋白表達占絲素重量的0.04%。融合到絲素的重組蛋白，能夠穩定地插入到不溶解性絲纖維中，在含bFGF的絲素構成的材料上培養細胞能活躍增殖。

利用絲素蛋白Fib-H啟動子表達系統，Kurihara等［9］將貓干擾素融合蛋白和攜有裂前蛋白酶（Prescission Protease）切割識別位點的絲素蛋白Fib-H重組piggyBac質粒在轉基因家蠶絲腺中表達，先用硫氰酸鋰溶解絲素，然后用PBS進行透析，再用裂前蛋白酶水解，收集重組貓干擾素，貓干擾素在這一過程中并沒有損失其生物活性，并且表現出高度抗病毒活性。Royer等［10］在PSG利用絲素糖蛋白啟動子（P25）表達系統表達了紅色熒光蛋白（DsRed），通過控制紅色熒光蛋白和糖蛋白組成的融合蛋白表達，證明家蠶P25蛋白系統也可以獲得完整的表達蛋白。

蜘蛛絲具有巨大的應用前景，而在自然條件下飼養蜘蛛幾無可能。利用Fib-H啟動子、部分蜘蛛絲纖蛋白編碼序列和piggyBac重組載體生產出能夠編碼蠶絲/蛛絲嵌合蛋白的轉基因家蠶。這些轉基因家蠶生產出的絲纖維是一種新型復合材料。蠶絲蛋白和蛛絲蛋白以一種極其穩定的方式嵌合到絲纖維中。不僅如此，與親代絲纖維相比，這些復合纖維的韌性總體上更強，并且與天然蜘蛛絲纖維韌性基本一致。上述結果表明，可利用轉基因家蠶生產蠶絲/蛛絲穩定嵌合纖維，從而顯著提升親代家蠶絲纖維的總體機械性質［11］。

人類細胞因子是由免疫細胞和一些非免疫細胞合成和分泌的一群小蛋白，在許多疾病的診斷和治療中具有廣泛的應用。已經在PSG中表達了幾種重組人類細胞因子。胰島素類生長因子（IGF-I），粒細胞-巨噬細胞集落生長因子（GM-CSF）。通過在人類或者小鼠中的生物活性實驗證明其生物活性。這些例子表明在家蠶絲腺中生產具有生物活性的重組蛋白是切實可行的。此外，Huan Wang等［15］利用PSG表達系統表達胎盤催乳素（HPL）重組蛋白，通過降低家蠶后部絲腺中內源性蛋白的表達，Fib-H的mRNA水平降低了71.1%，Fib-H在蠶絲蛋白中從91.86%降低到71.01%，而在總絲蛋白中，對應的HPL重組蛋白含量分別達到18.85%和15.46%。結果顯示降低家蠶后部絲腺中內源性蛋白的表達可有效提高重組外源蛋白的表達量。

2.3 利用中部絲腺表達重組蛋白

利用中部絲腺表達重組蛋白，分泌到絲膠層中，絲膠層比絲素蛋白親水性更好，通過這種方法從蠶繭中提取純化蛋白更有優勢。鑒于絲膠蛋白的含量是絲素的三分之一，所以必須在MSG細胞中研究具有高轉錄活性的調控序列用于基因表達。在MSG表達系統中，用源于BmNPV的增強子hr3和轉錄激活因子IE1，來增強絲膠Ser1啟動子的活性；通過利用hr3和IE1可使Ser1啟動子活性增強30多倍。利用這一表達系統，將一段信號肽序列加入到EGFP cDNA中促進細胞分泌EGP。與PSG表達系統不同，綠色熒光蛋白EGFP在MSG細胞中，以非融合蛋白形式表達，并分泌到蠶繭的絲膠層中，將蠶繭浸入到中性水溶液中可以方便的回收絲膠層中的EGFP，且不喪失其生物活性。上述的研究表明，與PSG相比，MSG表達系統有很多優勢。首先，重組蛋白以非融合蛋白的形式表達，因此無需蛋白酶處理便可收集。第二，通過將蠶繭浸入中性溶液中，便可從中提取重組蛋白，且不喪失重組蛋白的生物活性。第三，從蠶繭中提取的重組蛋白，只帶有少量的內源性絲蛋白，有利于后續的純化。

Ogawa等［17］通過利用增強子hr3連接Ser1啟動子和IE1基因，在轉基因家蠶的MSG細胞中表達重組人類血清白蛋白（HSA）。轉基因家蠶絲的絲膠層中含有重組HSA，濃度為3 μg/ml，蠶繭中的重組HSA可用PBS提取，然后進行硫酸銨沉淀和用瓊脂糖柱進行親和層析。純化的重組HSA的光譜與來源于血清的天然HSA一致，表明重組HSA的二級結構、三級結構與天然HSA一致。重組HSA的藥物結合性試驗結果也表明：重組HSA的藥物結合性與天然HSA非常相似，證明轉基因家蠶可以合成在結構和功能上與天然HSA一致的重組HSA。

段建平等［18］利用Ser1啟動子，以EGFP為篩選標記，將人腦源性神經營養因子（human brain-derived neurotrophic factor，hBDNF）基因重組到piggyBac載體并利用顯微注射到蠶卵中，在中部絲腺中獲得了較高水平的表達。

Wang等［19］通過與Ser1啟動子連接增強子，利用MSG表達系統高效表達了重組人酸性纖維母細胞生長因子，生物活性實驗證明其有較高的生物活性，表明在家蠶絲腺中生產具有生物活性的重組蛋白是切實可行的。

膠原蛋白是一種由三條α鏈組成的三螺旋蛋白。因為家蠶絲腺脯氨酰羥化酶活性低［20］，家蠶合成的重組α1（I）鏈不含有形成膠原蛋白三螺旋所需要的羥基脯氨酸，因此，重組α1（I）鏈并沒有按照設想的形成三螺旋結構。為了提高脯氨酰羥化酶的活性，Adachi等［21］把Ser1啟動子驅動脯氨酰羥化酶α亞基基因的piggyBac質粒用顯微注射法導入家蠶，獲得了脯氨酰羥化酶α亞基和人膠原蛋白同時在后部絲腺中分泌表達的轉基因家蠶，使脯氨酰羥化酶的活性提高了130倍，生產出I型膠原蛋白［α1（I）-chain］三螺旋α1-鏈。

小鼠單克隆抗體（mAb）分子IgG mAb由兩種多肽鏈組成，25-KDa的L鏈和50-KDa的H鏈。鏈的成分為L2H2。每條L鏈通過二硫鍵與H鏈連接，H鏈通過其它二硫鍵與其它H鏈結合。為了在家蠶中研究這種相當復雜的分子合成過程，制作了三種轉基因株系，L-，H-，和L/H-，分別對應合成小鼠IgG L-鏈，H-鏈，或者L-和H-鏈［22］。L-系家蠶分泌L-鏈，以單體形式進入蠶繭，而H-系家蠶分泌H-鏈，以二聚體和更高的分子復合物形式。在L/H系種，共表達的L-和H-鏈完全形成L2H2進入蠶繭中。在L/H系的蠶繭中幾乎檢測不到L-鏈單體或者H-鏈二聚體的存在。在L/H系的蠶繭中的H-鏈的含量大約是H-蠶繭的2.3倍。據此，家蠶的MSG細胞表達系統可合成并分泌帶有L2H2結構的重組mAb這種復雜分子的合成。在脊椎動物生產抗體的細胞中，通過L2H2能否有效合成并從細胞中分泌來判定mAb的合成分泌質量。

3 目前存在的問題和前景展望

家蠶絲腺作為一個天然高效合成蛋白質的生物反應器，對于生產在畜牧、獸醫科學、生物技術和制藥領域廣泛應用的重組蛋白有著重要作用。隨著對家蠶轉基因技術不斷探索與研究，轉基因技術體系將日趨成熟，在制作方法、載體、報告基因等方面都有了很大進展，獲得轉基因家蠶的成功率也越來越高，轉基因家蠶的應用將會越來越廣泛。利用轉基因家蠶絲腺生物反應器生產重組蛋白雖然已經取得了重大進步，但是仍存在許多亟待解決的問題。絲腺生物反應器表達重組蛋白的效率不夠高。例如表達系統的效率，密碼子使用偏向性，靶基因的復制數量，周圍基因組DNA對靶基因的位置效應等等。對于提高重組蛋白的表達水平也做了一些努力。包括，在PSG中過表達Ras1CA致癌基因能夠有效提高60%絲蛋白產量和蠶絲產量［23］，這對于提高重組蛋白的產量或許有所幫助。重組蛋白純化費用高昂，如何降低重組蛋白純化成本是決定能否工業化、商品化的關鍵。從可溶絲膠蛋白中提取重組蛋白比從不溶絲素蛋白中提取簡單，采用絲膠表達系統來生產重組蛋白用于后續純化，是最好的選擇，而絲蛋白表達系統更傾向于生產生物材料用的修飾絲纖維。重組蛋白的生物活性需要進一步提高。與哺乳動物相比，家蠶絲腺擁有相似的轉錄后修飾的模式與能力，如糖基化、磷酸化、蛋白質修飾，然而，重組人類膠原蛋白的例子證明，不是所有通過家蠶絲腺生產的重組蛋白都具有生物活性，這是蛋白質修飾不夠造成的，需進一步深入研究轉錄后修飾將使我們明白哪些重組蛋白適合在家蠶絲腺中生產。

利用家蠶絲腺巨大的蛋白合成能力，通過轉基因技術構建的家蠶絲腺生物反應器是一種安全、高效地生產重組蛋白的較好系統，目前，已經發展了五種利用Ser1啟動子、Fib-L啟動子、Fib-H啟動子和糖蛋白（P25）啟動子等在家蠶MSG或者PSG表達重組蛋白的表達系統。已經成功表達了多種生物活性蛋白，這其中包括生長因子，細胞因子，單克隆抗體，疫苗和膠原蛋白等等。與昆蟲、酵母和哺乳動物細胞表達系統相比，家蠶作為比較高級的真核生物，對于其遺傳基礎的研究也已非常充分，因此可作為生產重組藥物蛋白的理想宿主。生產可作為生物材料的經修飾絲纖維。帶有高抗菌性、高力學性，生物降解性，生物兼容性和其他特性的蠶絲生物材料，在骨骼、皮膚、軟骨、韌帶、血管、神經、眼睛、心臟，和膀胱組織等具有廣泛的生物工程應用。通過在絲腺中導入各種功能的DNA片段，便可利用家蠶作為生物反應器大規模生產這種生物材料。生產作為織物材料的經修飾絲纖維。天然的絲纖維具有很多顯著特性，但是也存在很多缺點，例如，易褶皺，易褪色，難梳理，難紡織，這些問題都是由其分子機制決定的。進行基因修飾是解決上述問題的有效途徑。已經證明在轉基因家蠶中生產高機械性能的改良絲纖維是切實可行的。在不遠的將來，越來越多通過轉基因家蠶生產的經基因修飾的絲纖維和新絲產品將面世，不斷豐富和美化我們的日常生活。

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The Perspective of Recombinant Protein Production Using the Silk Gland as a Bioreactor

HUANG Shao-hua1,DONG Jiu-ming2,LIU Yun-cai1,ZHAN Peng-fei3
（1.College of Animal Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.Zhejiang Provincial Technology Extension Center,Hangzhou 310029,China; 3.Huzhou Academy of Agricultural Sciences,Huzhou 313000 Zhejiang,China）

The silk gland of silkworm Bombyx mori has the excellent ability of synthesizing silk proteins.To utilize such capacity for mass production of useful proteins,transgenic silkworms were generated that synthesized recombinant proteins in the silk gland and secreted them into the silk cocoon.These recombinant proteins can be widely used in the biological,biotechnical and pharmaceutical applications.By controlling the expressed regions of the recombinant protein in the silk gland,Expression in the PSG or MSG led to localization in the insoluble fibroin core or hydrophilic outer sericin layer,respectively.This review focuses on using the silk gland of silkworm Bombyx mori as a bioreactor,and the possibility of utilizing it as a valuable tool for the mass production of therapeutic and industrially relevant recombinan proteins.The challenges and perspectives of recombinant protein production are also discussed.

Bombyx mori;transgenic silkworm;silk gland-bioreactor;recombinant protein

S881

A

0258-4069［2015］04-015-05

湖州市科技計劃（公益性技術應用研究）項目（No.2013GZ06），浙江省科技計劃項目（No.2014C32076），浙江省三農六方科技協作項目。

黃紹華（1992-），男，碩士研究生，主要從事蠶基因工程研究。E-mail：1035131921@qq.com

占鵬飛，男，農藝師。E-mail：fei2533817@163.com