雞群血凝抑制抗體水平快速測定法——β-微量法

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雞群血凝抑制抗體水平快速測定法——β-微量法

吳佳寧

(沈陽市動物疫病預(yù)防控制中心110000)

近年來養(yǎng)雞業(yè)有較快發(fā)展。但由于免疫失時，免疫不當和疫苗失效等多種原因致使雞新城疫仍有流行，一些免疫力低落的雞群，遇野外強毒侵襲時，有的引起急性暴發(fā)招致大批死亡，有的造成隱性感染而使野毒繼續(xù)潛留。這不僅給廣大農(nóng)戶帶來損失也威脅著養(yǎng)雞業(yè)的進一步發(fā)展。血凝抑制(HI)試驗比中和試驗簡單、方便。且HI抗體水平與攻毒保護有密切關(guān)系。

1器材

塑料微孔板：96孔V型凝集板，使用前后充分清洗，晾干。針管定量稀釋器：以4支全量0.25mL的注射器并聯(lián)制成，可以定量，前端接塑料滴頭，每擠一下為0.05mL。一次可同時稀釋4個樣品。然后更換干凈的滴頭再用。微型振蕩器：專用于微量凝集后的混合。也可用手振蕩混合。塑料采血管：內(nèi)徑2mL的聚乙稀塑料管，剪成10～12cm，備用。標準滴管：以靜脈注射管連接磨去尖端的18G號針頭，要求每滴0.025mL。

2試劑

磷酸緩沖鹽水(PBS)，用作稀釋液。高壓蒸氣滅菌，4℃冰箱保存，用時作20倍稀釋。濃縮抗原：以含有Lasota系病毒的尿囊液經(jīng)福爾馬林滅滅，聚乙二醇濃縮制成，其血凝價為5000～16000，用聚乙烯塑料管小劑量分裝，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?可在4℃下保存10個月以上，效價不變)。此抗原具有效價高、洗脫慢、耐長期保存和不散毒等優(yōu)點，每次作血凝抑制試驗按固定比例稀釋配制4個血凝單位濃度的抗原，抗原稀釋倍數(shù)按下式計算：(稀釋倍數(shù)=血凝效價/血凝單位數(shù))紅血球懸液，采成年雞血放入有8%檸檬酸鈉抗凝劑的試管中或等量Alsever液中(后者可在4℃下保存2周)，用20倍量的PBS洗滌血球，重復(fù)3～4次。每次2000轉(zhuǎn)、分離心5分鐘，最后一次離心10分鐘，吸取壓積血球，用PBS配成0.5%懸液，或先配成10%濃懸液(可在4℃下保存2～3天)用時進行20倍稀釋。標準陽性血清：采自高度免疫的公雞，經(jīng)效價測定后分裝小瓶，且在瓶簽上標明HI價，0℃冰箱存放待用。待檢血清：檢測雞群免疫水平時，每群隨機采血20～30份血樣，先用三棱針刺破翅下靜脈，隨即用塑料管引流血液至6～8cm長度。在酒精燈上將管一端燒融封口，或用石蠟封口，用膠布標明雞號或群號，置37℃溫箱中．2小時，待凝固拆出血清后以1000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，剪斷塑料管，將血清倒入一塊塑料板小孔中，如需較長時間保存，可在離心后將凝血塊一端剪去。滴融化石臘封口，凍存于0℃冰箱內(nèi)，用這種方法采血簡易、快速、對雞損傷小，尤適于雛雞采血，也便于采血后攜帶，存放和分離血清。

3試驗操作

微量血凝(HA)試驗。用定量稀釋器于每孔中加PBS0.05mL，共滴4排孔。以稀釋器吸1:5稀釋抗原于第一列孔，擠壓4～6次混勻后吸至經(jīng)二列孔，依次倍比稀釋，最后一列不加抗原作為對照。 換去稀釋器前端塑料管頭，再吸0.5%紅血球懸液依次加入各孔，每孔0.05mL。置微型振蕩器上振蕩1分鐘，或以手平持血凝板繞圓圈混勻。置室溫下(18～20℃)30～40分鐘，根據(jù)血球凝集圖象判定結(jié)果。以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝滴度，如用2為底的對數(shù)表示，則1代表第1個稀釋度(5×21)，2代表第2個稀度(5×22)，依次類推，其血凝滴度恰與板上出現(xiàn)完全凝集的最高孔數(shù)一致，(為精確比較不同抗原的血凝滴度，可將最高凝集孔后一孔的不全凝集狀態(tài)：25%、50%、75%的凝集分別以對數(shù)0.25、0.5、0.75表示，作為前面整數(shù)的尾數(shù))。每次做4個重復(fù)以幾何均值表示結(jié)果。

β-微量HI試驗。在96孔V型微孔板上進行，用針管定量稀釋器加樣和稀釋，一次可同時稀釋四個樣品。先取PBS0.05mL，放入第一孔和第12孔，再取濃度為4個血凝單位的抗原依次加入3～11孔，每孔0.05mL，第二孔加濃度為8個血凝單位的抗原0.05mL。用稀釋器吸待檢血清0.05mL于第一孔中(血清對照)擠壓混勻后吸0．05mL于第二孔依次倍比稀釋至第十一孔，最后棄去0.05mL。置室溫(18～20℃)下作用20min。用稀釋器滴加0.5%紅血球懸液于各孔中，振蕩混合后，室溫下靜置30～40min，判定結(jié)果。以完全抑制血球凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，如用以2為底的對數(shù)(Log2)表示，其HI滴度恰與板上出現(xiàn)完全抑制的最高孔數(shù)一致。