唐山地區(qū)漢族人群凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的關(guān)系研究

沈 揚(yáng)，李繁麗，孫麗霞

·論著·

唐山地區(qū)漢族人群凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的關(guān)系研究

沈 揚(yáng)，李繁麗，孫麗霞

目的 探究唐山地區(qū)漢族人群凝血因子Ⅶ(FⅦ)基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的關(guān)系。方法 選取2009年10月—2011年5月在河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院急診科住院的72例急性缺血性腦卒中患者作為觀察組，另選取2009年10月—2011年10月在河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院體檢的健康者88例作為對(duì)照組。采用基因測序方法檢測FⅦ基因R353Q(rs6046)位點(diǎn)多態(tài)性。比較兩組受試者基因型和等位基因分布頻率。結(jié)果 兩組受試者年齡、性別、吸煙率、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖(GLU)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。基因測序見FⅦ基因擴(kuò)增片段存在R353Q(rs6046)位點(diǎn)堿基轉(zhuǎn)換突變(G→A)，并發(fā)現(xiàn)2種基因型：純合子RR，雜合子RQ。兩組受試者FⅦ基因R353Q(rs6046)位點(diǎn)RR、RQ基因型及R、Q等位基因分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 唐山地區(qū)漢族人群FⅦ基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中無關(guān)。

卒中；凝血因子Ⅶ；基因多態(tài)性

缺血性腦卒中是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的多基因疾病，是指局部腦組織因血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧而導(dǎo)致的軟化壞死。患者神經(jīng)功能多呈進(jìn)行性受損，致殘、致死率高。組織因子和凝血因子Ⅶ(FⅦ)啟動(dòng)的外源性凝血途徑在血栓形成過程中起關(guān)鍵性作用。FⅦ基因多態(tài)性與血栓形成關(guān)系密切，且這種相關(guān)性與地域和種族有關(guān)。河北省唐山地區(qū)為腦卒中高發(fā)區(qū)，且低齡化趨勢明顯[1-2]。本研究旨在探討唐山地區(qū)漢族人群FⅦ基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年10月—2011年5月在河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院急診科住院的72例急性缺血性腦卒中患者作為觀察組，患者均經(jīng)顱腦CT或MRI掃描確診，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議1995年制定的“各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)”[3]。排除有血液系統(tǒng)疾病患者，嚴(yán)重肝腎功能不全患者，原發(fā)瓣膜性心臟病、心內(nèi)膜炎、心肌病患者。選取2009年10月—2011年10月在河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院體檢的健康者88例作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象為唐山地區(qū)無血緣關(guān)系漢族人。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組脫氧核糖核酸提取 取所有受試者外周靜脈血2 ml加入EDTA抗凝試管內(nèi)，采用OMEGA Blood DNA Kit試劑盒進(jìn)行蛋白酶裂解后置離心吸附柱提取基因組脫氧核糖核酸，紫外分光法鑒定后-20 ℃冰箱凍存。

1.2.2 FⅦ基因體外擴(kuò)增 根據(jù)NCBI FⅦ基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)特異擴(kuò)增FⅦ基因中含有R353Q(rs6046)位點(diǎn)的特異片段，精氨酸(Arg)縮寫為R，谷氨酰胺(Gln)縮寫為Q，核苷酸G/A突變后氨基酸R變Q。引物序列為：上游引物5′-CTACCCCATTAACTGCAGAAGAA-3′，下游引物5′-CCCCAAATATCACGGAGTACAT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性10 min，循環(huán)周期依次為：95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。引物序列由invitrogen合成，擴(kuò)增片段大小為356 bp。

1.2.3 FⅦ基因多態(tài)性分析 PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)ABI 3500測序儀進(jìn)行基因測序，測定rs6046位點(diǎn)核苷酸序列。

2 結(jié)果

2.1 基本資料 兩組受試者年齡、性別、吸煙率、TC、TG、LDL-C、GLU比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2 基因型分析 基因測序見FⅦ基因擴(kuò)增片段存在R353Q(rs6046)位點(diǎn)堿基轉(zhuǎn)換突變(G→A)，并發(fā)現(xiàn)2種基因型：純合子RR，雜合子RQ(見圖1)。其余擴(kuò)增片段序列分析未發(fā)現(xiàn)堿基突變。

注：A為G/A型，B為G/G型

圖1 FⅦ基因rs6046位點(diǎn)基因測序結(jié)果

Figure 1 Gene sequencing FⅦ gene rs6046 site

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)及基因型分布 兩組受試者FⅦ基因R353Q(rs6046)位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.249，P<0.05；χ2=0.048，P<0.05)。兩組受試者FⅦ基因R353Q(rs6046)位點(diǎn)RR、RQ基因型及R、Q等位基因分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表1 兩組受試者基本資料比較

注：*為經(jīng)自然對(duì)數(shù)(ln)轉(zhuǎn)化值；△為χ2值；TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，GLU=血糖

表2 兩組受試者FⅦ基因(rs6046)位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率比較〔n(%)〕

Table 2 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene FⅦ (rs6046) locus between the two groups

組別例數(shù)基因型RR RQ等位基因R Q對(duì)照組8884(95 5)4(4 5)172(97 7)4(2 3)觀察組7264(88 9)8(11 1)136(94 4)8(5 6)χ2值2 4612 365P值>0 05>0 05

3 討論

FⅦ是肝臟合成的一種維生素K依賴性凝血因子，為外源性凝血途徑的起始酶，并通過凝血因子Ⅸ參與內(nèi)源性凝血途徑。FⅦ基因位于第13號(hào)染色體長臂(13q34)，有8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子。目前認(rèn)為FⅦ活性(FⅦc)增高是缺血性腦卒中發(fā)生的危險(xiǎn)因素。FⅦ基因多態(tài)性是影響FⅦc的重要遺傳學(xué)因素，Green等[4]于20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)FⅦ基因第8外顯子MspI多態(tài)性位點(diǎn)，即第353位Arg密碼子發(fā)生堿基替換(G→A)，其編碼的氨基酸也突變?yōu)橄鄳?yīng)的Gln。R353Q多態(tài)性具有明顯的種族、地域差異[5]。連建華等[6]檢測河南漢族健康人群FⅦ基因R353Q位點(diǎn)的RR、RQ、QQ基因型頻率分別為0.864、0.132、0.004，R、Q等位基因頻率分別是0.930、0.070。黃志軍等[7]檢測華南漢族健康人群的RR、RQ、QQ基因型頻率分別為0.85、0.117、0.033，R、Q等位基因頻率分別是0.909、0.091。中國漢族人群RQ、QQ基因型、Q等位基因頻率明顯低于歐洲白人和印度人，略高于日本人。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組RR、RQ、QQ基因型頻率分別為0.955、0.045、0.000，R、Q等位基因頻率分別是0.977、0.023，觀察組Q等位基因頻率略高于對(duì)照組，提示中國漢族人群R353Q(rs6046)位點(diǎn)存在G→A單個(gè)堿基突變，但突變頻率低，與上述研究人群基因分布相一致。

連建華等[8]采用PCR限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析技術(shù)研究河南漢族缺血性腦卒中(含腦梗死、腔隙性腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作)患者FⅦ基因R353Q多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，R等位基因頻率低于正常對(duì)照組，認(rèn)為Q等位基因是缺血性腦卒中的遺傳保護(hù)因子。王敬民等[9]采用相同方法研究嘉興地區(qū)漢族高血壓人群FⅦ基因R353Q多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)腦梗死組RQ+QQ基因型頻率、等位基因頻率均明顯高于非腦梗死組。而Maguire等[10]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，歐洲白人、南亞人、日本人、臺(tái)灣人FⅦ基因R353Q多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生無相關(guān)性。本研究采用直接測序方法測定急性缺血性腦卒中患者FⅦ基因R353Q(rs6046)位點(diǎn)核酸序列，僅發(fā)現(xiàn)RR、RQ兩種基因型，未發(fā)現(xiàn)少見的QQ基因型，RR、RQ基因型分布頻率分別為0.889、0.111，R、Q等位基因分布頻率分別為0.944、0.056，其基因型分布及等位基因分布頻率與對(duì)照組無明顯差異，提示FⅦ基因多態(tài)性與缺血性腦卒中無關(guān)。

目前腦血管疾病已成為我國居民的首位死因，患病率和發(fā)病率呈上升趨勢。腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制及遺傳病因?qū)W研究上存在瓶頸，分子生物學(xué)診斷評(píng)估與治療干預(yù)仍有較大困難。國內(nèi)腦卒中相關(guān)基因多態(tài)性研究由PCR-SSCP、PCR-RFLP逐步向飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)、直接測序技術(shù)轉(zhuǎn)移[11]，但不同種族、人群中相關(guān)研究仍存在不完善、不完整之處，候選基因及其作用亦多有爭議。因此采用直觀可靠、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定、高通量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，深入研究腦血管疾病相關(guān)候選基因，可為進(jìn)一步分子水平研究、臨床干預(yù)奠定基礎(chǔ)。

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(本文編輯：毛亞敏)

Correlation between Gene Polymorphism of Coagulation Factor Ⅶ and Acute Ischemic Stroke in Han Population in Tangshan

SHENYang，LIFan-li，SUNLi-xia.DepartmentofHematology，theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050031，China

Objective To investigate the correlation between gene polymorphism of coagulation factor Ⅶ and acute ischemic stroke in Han population in Tangshan.Methods From October 2009 to May 2011 in the Department of Emergency，the Affiliated Hospital of Hebei United University，72 in-patients with acute ischemic stroke were selected as observation group；from October 2009 to October 2011 in the Affiliated Hospital of Hebei United University，88 healthy cases were selected as control group.Gene sequencing method was used to detect the polymorphism of coagulation factor Ⅶ gene R353Q(rs6046)locus，the gene types and allelic frequency were compared between the two groups.Results No statistically significant differences of age，gender，smoking rate，TC，TG，LDL-C，blood glucose was found between the two groups(P<0.05).Gene sequencing result showed that，there was conversion mutation of G→A in coagulation factor Ⅶ gene R353Q(rs6046)locus，and two gene types were found：RR and RQ.No statistically significant differences of RR gene type，RQ gene type，R or Q allelic frequency was found between the two groups(P>0.05).Conclusion No correlation was found between gene polymorphism of coagulation factor Ⅶ and acute ischemic stroke in Han population in Tangshan.

Stroke；Coagulation factor Ⅶ；Gene polymorphism

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20090557)

050031河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院血液科(沈揚(yáng))；河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院急診科(李繁麗，孫麗霞)

沈揚(yáng)，李繁麗，孫麗霞.唐山地區(qū)漢族人群凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的關(guān)系研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2015，23(5)：025-027.[www.syxnf.net]

R 743

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.05.007

2015-03-01，

2015-05-09)

Shen Y，Li FL，Sun LX.Correlation between gene polymorphism of coagulation factor Ⅶ and acute ischemic stroke in Han population in Tangshan[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(5)：025-027.