低氧性肺動脈高壓患者肺小動脈壁Siah1表達情況及其臨床意義

符代炎，戴愛國，胡瑞成，田 華，陳云榮，朱黎明

·論著·

低氧性肺動脈高壓患者肺小動脈壁Siah1表達情況及其臨床意義

符代炎，戴愛國，胡瑞成，田 華，陳云榮，朱黎明

目的 探討低氧性肺動脈高壓(HPH)患者肺小動脈壁Siah1表達情況及其臨床意義。方法 收集湖南省腫瘤醫院胸外科2008-04-01至2009-03-31行肺葉切除術的肺鱗癌患者36例，將除肺鱗癌外無其他肺部疾病患者12例納入對照組，COPD非肺動脈高壓患者12例納入COPD組，COPD并HPH患者12例納入PH組。收集患者肺組織，觀察其肺血管重塑指標〔肺小動脈管壁厚度/血管外徑(WT%)、肺小動脈管壁面積/管總面積(WA%)、肺小動脈管腔面積/管總面積(LA%)〕，采用原位雜交法與免疫組織化學法檢測肺小動脈壁Siah1 mRNA及其蛋白表達情況。結果 光鏡下可見對照組患者肺小動脈管壁薄，管腔大；COPD組患者肺小動脈管壁出現增厚，管腔狹窄；PH組患者肺小動脈管壁厚度進一步增加，管腔明顯變窄。COPD組患者WA%、WT%高于對照組，LA%低于對照組(P<0.05)；PH組患者WA%、WT%高于COPD組，LA%低于COPD組(P<0.05)。原位雜交結果顯示，對照組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA呈低表達，COPD組、PH組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA表達逐漸增高。免疫組織化學結果顯示，對照組患者肺小動脈壁Siah1蛋白呈低表達，COPD組、PH組患者肺小動脈壁Siah1蛋白表達逐漸增高。PH組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA相對表達量及其蛋白水平高于COPD組，COPD組高于對照組(P<0.05)。直線相關分析結果顯示，Siah1蛋白水平與Siah1 mRNA相對表達量呈正相關(r=0.873，P<0.01)；Siah1 mRNA相對表達量與WA%、WT%、肺動脈收縮壓(PASP)均呈正相關(r值分別為0.797、0.845、0.728，P<0.01)，Siah1蛋白水平亦與WA%、WT%、PASP呈正相關(r值分別為0.791、0.791、0.704，P<0.01)。結論 HPH患者肺小動脈壁Siah1呈高表達，且肺小動脈壁Siah1表達與低氧性肺血管重塑及PASP有關，可能機制為慢性肺泡性低氧上調患者肺小動脈壁Siah1表達，進而參與HPH的發病。

高血壓，肺性；缺氧；Siah1

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的常見病因，其中慢性低氧導致的低氧性肺血管重塑(hypoxic pulmonary vascular remodeling， HPSR)是HPH的主要發病環節[1]。Siah是果蠅sina(seven in absentia)基因產物的類似物，分為Siah1和Siah2兩個亞型[2]，其中擁有E3泛素連接酶活性的Siah1蛋白參與HPH大鼠HPSR的形成[3]，但在HPH患者肺動脈高壓形成過程中，Siah1的表達情況尚不清楚。本研究通過研究HPH患者肺小動脈壁Siah1表達情況，探討Siah1在HPH發病中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(streptavidin-biotin complex，SABC)免疫組織化學染色試劑盒、二甲氨基偶氮苯(dimethylaminoazobenzene，DAB)顯色試劑盒、地高辛標記多相寡核苷酸雜交探針(均為武漢博士德生物工程有限公司生產)，其中人Siah1 mRNA序列參照文獻[3]。Siah1抗體(美國Santa Cruz公司)，HP4500型彩色多普勒超聲診斷儀(美國惠普公司)，福田ST-150型肺功能儀(日本福田產業株式會社)，PIPS-2020型病理圖像分析系統(重慶天海醫療設備有限公司)。

1.2 診斷標準及排除標準 診斷標準：(1)采用多普勒超聲心動圖測量右心房瓣最大反流速度(V)，按照改良柏努力公式計算右心房、室壓差約等于4V2，再加上標準右心房壓10 mm Hg(1 mm Hg =0.133 kPa)即為估測的肺動脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure，PASP)[4]；(2)肺鱗癌的臨床分期依據美國聯合癌癥分類委員會和國際抗癌聯盟2002年制定的TNM分期標準；(3)COPD的診斷標準依據“慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)”[5]；(4)多普勒超聲心動圖在肺動脈高壓診斷或篩查中的價值與右心導管測量肺動脈壓的可靠性高度相關[6]，靜息狀態下經胸多普勒超聲心動圖估測PASP≥40 mm Hg診斷為肺動脈高壓[4]。排除標準[7-9]：(1)肺鱗癌和/或COPD以外的肺部疾病；(2)肺鱗癌壓迫肺血管；(3)睡眠呼吸障礙；(4)左心疾病；(5)嚴重肝臟、腎臟、內分泌疾病；(6)結締組織疾病；(7)先天性體-肺分流性心臟病；(8)HIV感染；(9)脾切除術后；(10)使用減肥藥。

1.3 臨床肺標本 收集湖南省腫瘤醫院胸外科2008-04-01至2009-03-31行肺葉切除術的肺鱗癌患者36例，均經病理確診，術前未行放化療及生物反應調節劑治療，術前完善三大常規、凝血全套、肝腎功能、血脂及血糖、甲狀腺功能七項、輸血前五項、自身抗體譜、細胞免疫及體液免疫、血氣分析檢查等，并行心功能、肺功能、胸部影像學、多普勒超聲心動圖等檢查。將除肺鱗癌外無其他肺部疾病的12例患者納入對照組，COPD非肺動脈高壓12例患者納入COPD組；COPD并HPH 12例患者納入PH組。本研究獲得湖南省腫瘤醫院倫理委員會批準。

1.4 肺小動脈形態學分析 選取遠離肺鱗癌5 cm以上、無癌浸潤的外周肺組織作為標本[10]，采用10%中性甲醛固定12 h，脫水后石蠟包埋，切片，厚度4 μm，HE染色，每個患者隨機選取3張切片，每張切片隨機選取5支直徑200 μm左右的肺小動脈，測定肺小動脈管壁厚度/血管外徑(WT%)、肺小動脈管壁面積/管總面積(WA%)、肺小動脈管腔面積/管總面積(LA%)作為肺小動脈重塑評價指標[11]。

1.5 肺小動脈壁Siah1原位雜交及結果分析 參照說明書及文獻[12]的雜交步驟，DAB顯色棕黃色為陽性。每例患者選3張結構完整的切片，每張切片以隨機選5支直徑100 μm左右的肺小動脈，檢測肺小動脈管壁平均吸光度(A)值作為管壁Siah1 mRNA相對表達量。

1.6 肺小動脈壁Siah1免疫組織化學檢測及結果分析 參照SABC免疫組織化學染色試劑盒說明書及文獻[12]的方法，其中一抗為1∶100稀釋，DAB顯色棕黃色為陽性。肺小動脈選擇及管壁Siah1蛋白相對表達量檢測同原位雜交。

2 結果

2.1 3組患者臨床資料比較 3組患者年齡、肺鱗癌分化程度、肺鱗癌臨床分期、肺標本取材部位及年齡比較，差異無統計學意義(P<0.05)；3組患者第一秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%)、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)、動脈血氧分壓(PaO2)及PASP比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。COPD組患者FEV1%、FEV1/FVC及PaO2低于PH組和對照組，PH組患者上述指標低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；PH組患者PASP高于對照組和COPD組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1、2)。

表1 3組患者臨床資料比較(例)

2.2 3組患者肺小動脈形態學改變 光鏡下可見對照組患者肺小動脈管壁薄，管腔大；COPD組患者肺小動脈管壁出現增厚，管腔狹窄；PH組患者肺小動脈管壁厚度進一步增加，管腔明顯變窄(見圖1)。3組患者WA%、WT%及LA%比較，差異有統計學意義(P<0.05)；COPD組患者WA%、WT%高于對照組，LA%低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；PH組患者WA%、WT%高于COPD組，LA%低于COPD組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表2 3組患者臨床資料比較

注：FEV1%=第一秒用力呼氣容積占預計值百分比，FEV1/FVC=第一秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比，PaO2=動脈血氧分壓，PASP=肺動脈收縮壓；與對照組比較，△P<0.05；與COPD組比較，▲P<0.05

表3 3組患者WA%、WT%及LA%比較

注：WA%=肺小動脈管壁面積/管總面積，WT%=肺小動脈管壁厚度/血管外徑，LA%=肺小動脈管腔面積/管總面積；與對照組比較，△P<0.05；與COPD組比較，▲P<0.05

2.3 3組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA表達及其蛋白水平比較 原位雜交結果顯示，對照組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA呈低表達，COPD組、PH組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA表達逐漸增高，見圖2。免疫組織化學結果顯示，對照組患者肺小動脈壁Siah1蛋白呈低表達，COPD組、PH組患者肺小動脈壁Siah1蛋白表達逐漸增高，見圖3。3組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA相對表達量及其蛋白水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中PH組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA相對表達量及其蛋白水平高于COPD組，COPD組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

圖1注：A為對照組，B為COPD組，C為PH組

Table 4 Comparison of mRNA relative expression and protein level of Siah1 in pulmonary arteriole walls among the three groups

組別例數Siah1mRNA相對表達量Siah1蛋白對照組120 033±0 0050 035±0 005COPD組120 077±0 009△0 068±0 008△PH組120 089±0 010△▲0 078±0 010△▲F值150 815126 604P值<0 01<0 01

注：與對照組比較，△P<0.05；與COPD組比較，▲P<0.05

2.4 相關性分析 直線相關分析結果顯示，PaO2與WA%、WT%、PASP均呈負相關(r值分別為-0.694、-0.781、-0.833，P<0.01)。WA%、WT%與PASP均呈正相關(r值分別為0.814、0.857，P<0.01)。Siah1蛋白水平與Siah1 mRNA相對表達量呈正相關(r=0.873，P<0.01)。Siah1 mRNA相對表達量與WA%、WT%、PASP均呈正相關(r值分別為0.797、0.845、0.728，P<0.01)，Siah1蛋白水平亦與WA%、WT%、PASP呈正相關(r值分別為0.791、0.791、0.704，P<0.01)。

3 討論

慢性肺泡性低氧誘導肺血管重塑是COPD引起HPH的主要原因[12]。本研究結果顯示，COPD組患者PaO2低于對照組，肺小動脈管壁出現增厚，肺小動脈管腔變窄，圖像分析結果顯示WA%與WT%增加、LA%降低，提示COPD組患者發生HPSR；PH組患者PaO2進一步降低，HPSR更明顯。相關性分析顯示，PaO2與WA%、WT%、PASP均呈負相關，WA%、WT%與PASP均呈正相關，證實慢性肺泡性低氧誘導HPSR，導致肺血管阻力增加，進而引起HPH。

Siah1在哺乳動物中高度保守，低氧可誘導其表達[13]。本課題組進行的前期研究提示，慢性低氧可誘導大鼠肺小動脈壁Siah1表達增加，進而參與大鼠HPH的發病[3]。本研究結果顯示，對照組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA及其蛋白呈低表達，COPD組、PH組患者肺小動脈壁Siah1 mRNA及其蛋白表達逐漸增高，且兩者在時間上相一致。相關性分析顯示，肺小動脈壁Siah1蛋白水平與Siah1 mRNA相對表達量呈正相關，提示慢性肺泡性低氧同樣可上調肺小動脈壁Siah1的表達。本課題組進行的前期研究結果顯示，脯氨酰羥化酶1、脯氨酰羥化酶3及低氧誘導因子抑制因子蛋白水平降低在大鼠HPH發病中具有重要作用[14-15]；有研究結果顯示，Siah1可介導脯氨酰羥化酶1、脯氨酰羥化酶3及低氧誘導因子抑制因子經泛素蛋白本酶體途徑降解[13，16]。本研究結果顯示，肺小動脈壁Siah1 mRNA相對表達量及其蛋白水平均與WA%、WT%、PASP呈正相關，提示Siah1可能參與HPH的發病，究其原因，可能與慢性肺泡低氧上調患者肺小動脈壁Siah1表達，進而降低脯氨酰羥化酶1、脯氨酰羥化酶3及低氧誘導因子抑制因子的蛋白水平有關，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，HPH患者肺小動脈壁Siah1呈高表達，且肺小動脈壁Siah1表達與HPSR及PASP有關，可能機制為慢性肺泡性低氧上調患者肺小動脈壁Siah1表達，進而參與HPH的發病。

【編后語】

作者所在課題組通過一系列基礎及臨床研究探討了低氧性肺動脈高壓對Siah1表達的影響，認為Siah1參與了低氧性肺動脈高壓的發病，但單就本研究來講，選取的研究對象均為肺鱗癌患者，未設置正常對照，且樣本量較小，期待能在以后的研究中加以完善，以更好地指導臨床。

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(本文編輯：謝武英)

Expression of Siah1 of Pulmonary Arteriole Walls and Its Significance in Patients with Hypoxic Pulmonary Hypertension

FUDai-yan，DAIAi-guo，HURui-cheng，etal.Hu′nanProvincialGeriatricHospital；DepartmentofRespiratoryMedicine，Hu′nanGerontologyInstitute；DepartmentofRespiratoryMedicine，MawangduiSanatoriumofHu′nanProvince，Changsha410016，China

Objective To investigate the expression of Siah1 of pulmonary arteriole walls and its significance in patients with hypoxic pulmonary hypertension.Methods From 2008-04-01 to 2009-03-31，a total of 36 lung squamous carcinoma patients undergoing pulmonary lobectomy were selected in the Department of Thoracic Surgery，Hu′nan Provincial Tumor Hospital，thereinto 12 patients without other pulmonary disease were served as A group，12 patients with COPD were served as B group，12 patients with COPD and hypoxic pulmonary hypertension were served as C group.Pulmonary vascular remodeling index including WT%，WA%，LA% was compared among the three groups；insitu hybridization method was used to detect the Siah1 mRNA expression，and immunohistochemical method was used to detect the Siah1 protein expression.Results Light microscope found that，the pulmonary arteriole walls of A group was thin，and the lumen was big；the pulmonary arteriole walls of B group was thickening，and the lumen was narrow；the pulmonary arteriole walls of C group was more thickening than that of B group，and the lumen was obviously narrow.WA% and WT% of B group were statistically significantly higher than those of A group，while LA% of B group was statistically significantly lower than that of A group(P<0.05)；WA% and WT% of C group were statistically significantly higher than those of B group，while LA% of C group was statistically significantly lower than that of B group(P<0.05).By insitu hybridization method and immunohistochemical method，Siah1 mRNA expression and protein expression of A group were low，and those of groups B and C were increasingly higher.mRNA relative expression and protein level of Siah1 of C group were statistically significantly higher than those of B group，and those of B group were statistically significantly higher than those of A group(P<0.05).Linear correlation analysis showed that，mRNA relative expression of Siah1 was positively correlated with protein level of Siah1(r=0.873，P<0.01)；mRNA relative expression of Siah1 was positively correlated with WA%，WT%，PASP，respectively(r=0.797，0.845，0.728，P<0.01)；protein level of Siah1 was positively correlated with WA%，WT%，PASP，respectively(r=0.791，0.791，0.704，P<0.01).Conclusion The expression of Siah1 of pulmonary arteriole walls is high in patients with hypoxic pulmonary hypertension，and it is correlated with hypoxic pulmonary vascular remodeling and PASP；chronic alveolar hypoxia may induce the expression of Siah1 of pulmonary arteriole walls，and lead to hypoxic pulmonary hypertension at last.

Hypertension，pulmonary；Anoxia；Siah1

國家自然科學基金資助項目(30971329，81270118)；湖南省自然科學基金資助項目(12JJ3111)；湖南省中醫藥科研計劃項目(2013138)

410016湖南省長沙市，湖南省老年醫院 湖南省老年醫學研究所呼吸疾病研究室 湖南省馬王堆療養院呼吸內科

戴愛國，410016湖南省長沙市，湖南省老年醫院 湖南省老年醫學研究所呼吸疾病研究室 湖南省馬王堆療養院呼吸內科；E-mail：daiaiguo2003@163.com

R 544

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.05.009

2015-02-13；

2015-05-09)

符代炎，戴愛國，胡瑞成，等.低氧性肺動脈高壓患者肺小動脈壁Siah1表達情況及其臨床意義[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(5)：031-035.[www.syxnf.net]

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