不同NO3--N /NH4+-N配比對紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響

范俊俊，劉曉靜，張曉玲，齊 鵬

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 資源與環境學院,甘肅 蘭州 730070)

不同NO3--N /NH4+-N配比對紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響

范俊俊1，劉曉靜1，張曉玲1，齊 鵬2

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 資源與環境學院,甘肅 蘭州 730070)

在完全營養液條件下，采用砂培法，研究了NO3--N與NH4+-N兩種氮素形態的7種配比(氮素水平210 mg/L)對紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響。結果表明：各形態配比下紫花苜蓿的株高、生物量、根瘤數、根瘤重及固氮酶活性均隨NO3--N/NH4+-N增大呈先增大后減小的趨勢；且NO3--N/NH4+-N比例為5/3時，紫花苜蓿的株高、生物量、根瘤數、根瘤重及固氮酶活性均取得最大值，而地上部和地下部全氮含量則在5/5時最高。綜合分析，當氮素水平在210 mg/L時，5/3處理下紫花苜蓿生長較好，自身固氮能力較強。

紫花苜蓿；NO3--N/NH4+-N；生長；結瘤固氮

氮素既可以被作物以陰離子NO3--N形式吸收，也可以被作物以陽離子NH4+-N形式吸收[1]，且這兩種形態是植物吸收利用的兩種主要氮源形式[2]。銨態氮可直接被植物利用合成氨基酸，而植物吸收的硝態氮則必須經過還原形成銨態氮后才能被利用[3]。從生物能學的角度來看，銨態氮在同化前不需要被還原，應該是植物優先利用的氮源[4]。因此，對于大多作物而言，植株在NO3--N營養下生長良好。研究表明，NO3--N可以促進植物根系的長度生長以及表面積和密度的增加[5]，NH4+-N可以促進紫花苜蓿生物量積累和結瘤固氮[6]。裴文梅等[7]用營養液培養甘草的研究表明，硝態氮與銨態氮等量配合施用時，甘草根的產量、整株合成的藥用成分均最高。與單一的NO3--N或NH4+-N比，NO3--N和NH4+-N以適度比例混合施用可以更好的促進絕大多數旱作作物生長。

有關氮素形態配比對植物的影響報道很多，而在最適氮素濃度下NO3--N/NH4+-N對紫花苜蓿影響尚未見報道。為了進一步研究氮素形態不同配比對‘甘農3號’紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響，采用砂培法，在一定氮素水平下(210 mg/L)，研究不同的配比對‘甘農3號’紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響，以期為紫花苜蓿合理的氮素供應提供理論依據和數據支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試品種‘甘農3號’紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)，供試菌株為中華根瘤菌(12531)，來源苜蓿根瘤和誘變菌株，均由甘肅農業大學草業學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗砂處理 將粗砂經自來水沖洗多次，直到沖洗用水不再渾濁為止，再用蒸餾水沖2～3次。121 ℃滅菌，150 ℃烘干后，備用。

1.2.2 種子處理 選取大小均勻，顆粒飽滿的紫花苜蓿種子，95%乙醇浸泡5 min，0.1% HgCl2溶液滅菌3 min，無菌水沖洗5～6次，最后用無菌濾紙吸干，備用[8]。

1.2.3 根瘤菌培養 將中華根瘤菌(12531)采用平板劃線培養，挑起單個菌落，將其接入YMA液體培養基[9]。在28 ℃下120 r/min的恒溫搖床上培養至菌液的光密度值(D600nm)≥1.0時，再在10 000 r/min下離心10 min，除去上清液用無菌水洗下根瘤菌體并配制成吸光值為0.6的菌懸液，備用。

1.2.4 營養液配置 (1)Fahraeus無氮植物營養液：Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，檸檬酸鐵0.005 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson微量元素1 mL，H2O 1 000 mL，pH 6.5～7.0。

(2)Gibson微量元素液：H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g ，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·4H2O 2.03 g ，Na2MoO4·2H2O 1.26 g，H2O 1 000 mL[10]。

1.3 試驗設計

選用直徑16 cm、高20 cm 的花盆，裝入經自來水沖洗再用蒸餾水清洗并經過高溫滅菌的粗砂10 kg。每盆播種100粒滅菌種子，播種14 d后進行間苗，每盆定苗50株，然后澆入營養液，置于塑料防雨棚內。根據前期試驗結果[11，12]設氮素水平為210 mg/L(以純氮計)，設NO3--N、NH4+-N兩種氮素形態7種配比，NH4+-N/NO3--N分別為12.5/87.5；25/75；37.5/62.5；50/50；62.5/37.5；75/25；87.5/12.5，即：1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1,共7個處理，每處理重復10次，完全隨機排列。以Fahraeus無氮植物營養液為基本營養液，分別加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素濃度，并調節pH7，結合無氮營養液一同施入。

2014年4月10日播種，每日噴澆3次蒸餾水，每次100 mL，直至對生真葉完全展開；之后每周淋澆1次配制營養液，每次500 mL；每7 d用蒸餾水淋洗盆栽1次以防止砂培中鹽分積累，而后澆入新配置營養液。紫花苜蓿生長至三片復葉時，每盆接種新培養的苜蓿根瘤菌液50 mL。在盛花期測定紫花苜蓿株高，生物量，根瘤數，根瘤重，固氮酶活性及全氮含量。

1.4 測定方法

每個處理隨機取30株單株測定植株高度，取平均值；取樣洗凈用濾紙吸干地上部和地下部水分，放入烘箱105 ℃下殺青15 min，再在65～75 ℃下烘干至衡重，稱其干重，每個處理重復6次。

每處理取10株，統計單株根瘤數。將每個單株上摘下的根瘤在電子天平上稱根取鮮根瘤重，每個處理重復10次。

固氮酶活性采用乙炔還原法測定[13，14]。稱取0.2 g的新鮮根瘤置于11 mL玻璃瓶中，加蓋橡皮塞后，從中吸出1.1 mL空氣，注入1.1 mL乙炔，室溫下反應30 min后，待機器穩定后，用微量注射器抽取混合氣體50 μL注入氣相色譜儀(GC)進樣柱中，測定C2H2、C2H4峰值。然后，在同樣條件下用標準乙烯測定并繪制乙烯的標準曲線，由此計算根瘤樣品的固氮酶活性。每個處理3次重復。測定儀器為GC-7890F氣相色譜儀，柱溫170 ℃，進樣器140 ℃，FID檢測器150 ℃。氣體壓力N2為0.3 mPa，H2為0.08 mPa，空氣為0.15 mPa。C2H4水平μmol/(g·h) =h·x(樣品峰面積)×C(標準C2H4水平，μmol/mL)/ hs(標準C2H4峰面積)×24.9×t(C2H2反應時間，h)×m(瘤重，g)。

植株全氮含量采用濃H2SO4-H2O2法測定[15]，每個處理重復3 次。

1.5 數據處理

采用Excel 2003軟件進行數據整理，并用SPSS 17.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 NO3--N/NH4+-N對紫花苜蓿盛花期株高、地上、地下生物量的影響

在供氮水平一定的條件下，隨NO3--N/NH4+-N增大，株高呈先增后減的趨勢(表1)，NO3--N/NH4+-N為5/3時，其株高為39.33 cm，顯著高于其他處理(P<0.05)。植株高度是衡量牧草生長狀況的重要指標，與產量呈正相關，高植株通常有更高的相對產量潛力[16]，因此，5/3處理時地上生物量也最大。當NO3--N/NH4+-N大于5/5時，NO3--N所占比例大的處理地上生物量大于NH4+-N比例大的處理。地下生物量隨處理的不同與地上生物量基本呈相同的變化趨勢，其最大與最小值分別出現在5/3和3/1處理。

表1 NO3--N /NH4+-N配比下紫花苜蓿的株高、地上、地下生物量Table1 Effects of NO3--N /NH4+-N on the plant height,aboveground and underground biomass of alfalfa

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 NO3--N/NH4+-N對紫花苜蓿盛花期根瘤數、根瘤重和固氮酶活性的影響

從量化的根系形態指標能夠較為直觀的判斷硝銨配比對紫花苜蓿長勢的影響。除1/7外，隨著NO3--N/NH4+-N比例的增加，根瘤數先增加后減小(表2)。根瘤數在5/3處理下達到最大，為每株36.3個；7/1處理時根瘤數最少，每株僅為11.3個。植株單株根瘤數越多，其根瘤重越重。根瘤干重與鮮重均與根瘤數呈現相同的趨勢，且5/3處理時最重，與其他處理差異顯著(P<0.05)。根瘤數、根瘤重均表現為NH4+-N>NO3--N。固氮酶活性的高低反映其固定大氣中氮的能力強弱。NO3--N/NH4+-N為5/3時，固氮酶活性最高，顯著高于其他處理(P<0.05)，與最低處理1/3相比增加了67.8%。由此可見NO3--N/NH4+-N為5/3時，紫花苜蓿自身固氮能力最強。

表2 NO3--N /NH4+-N配比下紫花苜蓿的根瘤數、根瘤重和固氮酶活性Table2 Effects of NO3--N /NH4+-N on root nodule number,root nodulation and nitrogenase activity of alfalfa

2.3 NO3--N/NH4+-N對花苜蓿盛花期地上和地下部全氮含量的影響

地上部和地下部全氮含量在NO3--N/NH4+-N為5/5時最高(圖1)，分別為2.76%和2.47%，顯著高于其他處理(P<0.05)。地上部分全氮含量NO3--N/NH4+-N為5/3時最小，為2.03%；處理1/7、1/3、5/5、3/1、7/1顯著高于5/3和3/5，而1/7、1/3、3/1、7/1之間差異不顯著。地下部分全氮含量在3/1處理下最低，為1.87%；由此可見，當氮素水平一定時，NO3--N/NH4+-N比例并不是影響紫花苜蓿全氮含量的主要因素。

圖1 NO3--N/NH4+-N配比下紫花苜蓿的地上、地下部全氮含量Fig.1 Effects of NO3--N/NH4+-N on aboveground and aboveground nitrogen content of alfalfa

3 討論與結論

研究報道，施氮不僅能提高紫花苜蓿的生物產量[17]和種子產量，還能增加其干物質和氮素積累量[18]，可明顯改善紫花苜蓿的品質[19]。朱祝軍等[20]研究發現，適宜的硝態氮與銨態氮配比有利于菜豆的生長發育。董守坤等[21]在大豆的研究上表明NH4+-N 和NO3--N的共同存在更有利于大豆的生長。Britto等[22]認為,在高比例的硝態氮或銨態氮處理下,過多的能量消耗用于 NO3--或NH4+的轉移,從而導致蛋白質和糖類合成的減少。孫園園等[23]發現菠菜在銨硝配比為25∶75 的營養液中產量最高，銨硝配比超過50∶50 時產量下降。試驗研究表明：盛花期，NO3--N/NH4+-N<5/3時，地上以及地下生物量均大于NO3--N/NH4+-N>5/3的處理。NO3--N/NH4+-N為5/3時，株高顯著高于其他處理，而地上生物量與地下生物量分別顯著高于除1/7和5/5以外處理。因為NO3--N和NH4+-N同時存在于生長的介質中會相互影響彼此的吸收速率及吸收動力學，NO3--N可以促進植物對NH4+-N的吸收[11]，在硝態氮供應充足的情況下，根系多吸收了銨態氮，從而促進了根系的生長[24]。另外，適當增施銨態氮促進了地上部的生長，光合作用增強，因此，生物量也會增加。Walch-Liu等[25]也發現的銨態氮易導致植物體內激素平衡的失調和細胞分裂素含量急劇下降,降低氮同化能力，從而影響作物的產量。

根瘤固氮酶活性是衡量豆科植物固氮有效性的重要指標。蒯佳林[26]研究發現，NH4+-N 培養下紫花苜蓿根瘤數量、根瘤固氮酶活性和均明顯好于NO3--N 培養。宋海星等[27]研究表明，NO3--N與NH4+-N 均不同程度地抑制根瘤固氮酶活性，但NH4+-N對根瘤固氮的抑制作用明顯低于NO3--N。葉芳等[11]研究發現，適量的NO3--N和NH4+-N均能促進紫花苜蓿結瘤固氮，但二者以一定的比例混合效果更佳。試驗研究表明：氮素水平一定時，NO3--N/NH4+-N為5/3時，根瘤數，根瘤重最大；而NO3--N/NH4+-N>5/3時，根瘤數、根瘤重以及固氮酶活性均減小，這與以上學者的研究結果相一致，并得出了NO3--N/NH4+-N的最佳配比。

在氮素水平為210 mg/L下，NO3--N /NH4+-N比例為5/3，即NO3--N /NH4+-N為62.5/37.5時，紫花苜蓿生長較好，且自身固氮能力較強。

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Effects of the ratios of NO3--N /NH4+-N on growth,nodulation and nitrogen-fixation of alfalfa at flowering stage

FAN Jun-jun1,LIU Xiao-jing1,ZHANG Xiao-ling1,QI Peng2

(1.CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China；2.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystemofMinistryofEducation/Sino-U.S.CentersforGrazingLandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China;3.CollegeofResourcesandEnvironmentalScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

Under the condition of complete nutrient solution,the effect of 7 ratios of NO3--N/NH4+-N (the nitrogen level was 210 mg/L) on growth，nodulation and nitrogen-fixation of alfalfa were studied at flowering stage by sand culture method.The results showed that along with the increase of NO3--N/NH4+-N ratio,plant height,biomass,nodule number,nodule weight and nitrogenase activity showed a trend of increasing first and then decreasing under different ratios of NO3--N/NH4+-N.The plant height,biomass,nodule number,nodule weight and nitrogenase activity of alfalfa achieved the maximum at 5/3,while the total nitrogen content of aboveground and underground were highest at 5/5.Under the nitrogen level of 210 mg/L,alfalfa performed best under 5/3 treatment and the nitrogen-fixing ability was the strongest as well.

alfalfa;ratios of NO3--N /NH4+-N;growth;nodulation and nitrogen-fixation

2014-12-08；

2014-12-24

國家自然科學基金(31460622)；甘肅省財政廳項目“外源氮素供應對紫花苜蓿產量和品質形成影響研究”資助

范俊俊(1989-)，男，甘肅天水人，碩士研究生。 E-mail：fan1990124@163.com 劉曉靜為通訊作者。

S 144.5

A

1009-5500(2015)01-0044-05