蛋白質組學在牛屬動物疾病中的研究與應用

李 偉，王 芳，殷元虎，郭春暉，殷溪瀚

(1.黑龍江省畜牧研究所 161005；2.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院 161006；3.黑龍江八一農墾大學動物科技學院 163319)

蛋白質組學在牛屬動物疾病中的研究與應用

李 偉1，王 芳2，殷元虎1，郭春暉1，殷溪瀚3

(1.黑龍江省畜牧研究所 161005；2.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院 161006；3.黑龍江八一農墾大學動物科技學院 163319)

蛋白質組學是對基因組學研究的重要補充，生命的各個過程都受到蛋白質間相互作用的控制。它是一個客觀的、復雜的、交錯并精密調控的反應網絡。在動物發育、生理生態、疾病等研究中得到廣泛應用。如何利用系統生物學的理念，將這些研究成果加以整理、整合，從而在蛋白質水平上對生命現象加以解釋，這需要遺傳學、化學、生物學、細胞生物學、工程學、數學、信息學等多學科學者共同的努力。本文介紹了蛋白質組學發展背景和關鍵技術的研究情況，并對蛋白質組學在牛屬動物疾病中的研究與應用進行了闡述。同時對蛋白質組學的發展前景進行了討論。

蛋白質組學；牛；疾病；生物信息學；乳房炎；蛋白質芯片技術

1 蛋白質組學的發展背景

1953年，Watson和Crick建立了著名的DNA雙螺旋結構模型，標志著基因時代的到來。1990～2001年人類基因組計劃(Human Genomic Project ,HGP)的完成。2001年2月15日，在Nature上一篇“現在應該是蛋白質組了”的消息，宣布了人類蛋白質組組織(Human Proteome Organization, HUPO)成立[1]，并提出了人類蛋白質組計劃(Human Proteome Project，HPP)[2], 標志著人類進入了后基因組時代。現在我們已經知道，機體內各種生命信息由不同基因經轉錄、翻譯，傳遞到相應蛋白質進行表達，表現為生命活性。目前，以對生物體或細胞的所有蛋白質進行鑒定和結構功能分析為基礎，獲得蛋白質水平上關于疾病發生，細胞代謝，營養吸收等過程的全面認識為研究目標的蛋白質組學越來越受到人們的重視。蛋白質組(proteome)的概念最早由Wasinger V.C.(1995)[3]提出，是指由一個基因組編碼的所有蛋白質。澳大利亞學者Wilkins M R & Williams K L(1997)[4]第一次在專著中使用并定義為：一個基因組或組織所表達全部蛋白質。現在蛋白質組可以理解為一種生物、個體、器官、組織、細胞及體液等的基因組所表達的全部蛋白質[5]，蛋白質組學研究內容包括蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等。需要指出的是一個蛋白質組并不是一個基因組的直接產物，機體蛋白質組中蛋白質的數量要遠遠多于基因組中基因的數量。蛋白質之間的相互作用和協調是細胞代謝活動的基礎，在細胞增值，分化，凋亡和衰老等生命活動中，蛋白質不僅有表達時間、表達量上的差異，而且能對外界環境刺激(物理、化學、生理、病理信號)等刺激產生反應，形成基因緩沖從而適應環境變化。生命每個過程都受到蛋白質間相互作用的控制。它是一個客觀的、復雜的、交錯的并精密調控的反應網絡。因此，要得到細胞內全部蛋白質組十分困難。為此，Humphery Smith et al.(1997)[6]提出功能蛋白質組的概念，指在特定時間、特定環境和實驗條件下基因組所表達的蛋白質。

2 蛋白質組學研究領域與研究內容

蛋白質組學研究已經滲透到臨床醫學、預防醫學、基礎醫學、藥學、動物學、植物學、植物病理學、營養學等多個學科領域。主要分為三個方向：①對蛋白質的大規模識別和翻譯后加工修飾的細微特征分析，稱為組成蛋白質組學；②借助蛋白質差異性顯示法進行分析蛋白質的水平，稱為差異顯示蛋白質組學(differential display proteomics)又叫比較蛋白質組學(comparative proteomics)或表達蛋白質組學(expression proteomics)；③應用質譜分析或酵母雙雜交法研究蛋白質與蛋質之間的相互作用，用以繪制某個體系的蛋白質作用的網絡圖譜，稱為相互作用蛋白質組學。

蛋白質組的研究一般分為3個步驟：第一，蛋白質組分離技術。主要有雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)技術，因其高分辨率的優點現在被人們廣泛使用，但也存在難以分離檢測低豐度蛋白，極端酸堿性蛋白和疏水蛋白等缺點。非平衡pH梯度電泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis, NEPHGE)，主要用于堿性蛋白質的分離。Blue native-PAGE雙向電泳(BN- PAGE)，主要用于膜性蛋白復合體等分子量大的蛋白質的分離。此外還有雙向高效柱層析技術和液相柱色譜分離技術。第二，蛋白質的鑒定。80年代末以基質輔助激光解析電離(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization, MALDI)和電噴霧電離(Electrospray Ionization ,ESI)[7，8]兩項技術為基礎，發展起來的基質輔助飛行時間質譜(matrix-assisted laser desportion ionization，MALDI-TOF-MS)，是當前最常用的分析技術。應用質譜技術可以得到蛋白質的肽質量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)，進而分析鑒定蛋白質。現在一些分離與鑒定技術相結合的方法在實踐應用效果較好如2-DE與免疫印跡技術相結合的方法-血清蛋白質組學分析方法(serum proteomics analysis, SERPA)，在篩選與腫瘤相關的蛋白質應用較廣。蛋白質芯片技術(protein chip & protein microarray)，現在應用較多的是蛋白質芯片與質譜技術相結合的表面增強激光解析離子化飛行時間質譜 (surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)技術。生物分子相互作用的分析技術(biomolecular interaction analysis, BIA)與MALDI-TOF-MS結合形成生物傳感芯片質譜，可用于蛋白質的功能特性研究和蛋白質結構的分析。生物化學型蛋白質芯片，將已知的生物活性分子結合到芯片表面，來捕獲樣品中的靶蛋白。同位素標簽相對絕對定量(iTRAQ)技術[9,10]，能對肽段進行相對定量MS / MS，二級質譜也就是串聯質譜鑒定。iTRAQ技術可檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。

第三，應用生物信息學及蛋白質組信息學數據庫對鑒定結果進行存儲、處理、對比和分析。

注：引自 R. J. 辛普森. 2003. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual[11]。

3 蛋白質組技術在牛疾病上的研究

3.1 蛋白質組技術在健康牛上的研究

首先需要對正常牛體不同組織和細胞的蛋白質組有個基礎了解，才能進一步研究疾病對牛蛋白質組的影響(牛麗莉 等，2009[12],楊永新 等，2010[13])。不同體細胞數牛乳中乳蛋白比較蛋白質組學進行了研究(楊永新 等，2011)[14]。李珊珊(2011)[15]對圍產期奶牛血清蛋白質組學進行了初步研究； Lu et al. (2013)[16]研究了干奶期奶牛的牛奶中與能量平衡相關的蛋白質組和代謝組的變化。劉榮 等(2012)[17]優化了奶牛乳腺上皮細胞核蛋白質組雙向電泳方法，并在此基礎上研究了中藥王不留行對奶牛乳腺上皮細胞核蛋白質組學的影響(劉榮，2012)[18]。

3.2 蛋白質組技術在牛乳房炎上的研究

乳房炎是影響奶業生產的主要疾病，蛋白質組學研究的研究也較多(張勇，2009[19], 楊永新，2010[20])，而且越來越具針對性，學者們對大腸桿菌性乳房炎(楊永新 等，2010[21])和金黃色葡萄球菌乳房炎(Reinhardt , 2013[22])進行了蛋白質組分析。學者們在蛋白質組水平上研究亞臨床和臨床乳房炎的奶牛抵御不同病原體的反應，并篩選了潛在蛋白質的為生物標記物，為更好地理解乳房炎發病機理提供了研究方向(Romana ，2012[23])。

3.3 蛋白質組技術在牛布氏桿菌上的研究

牛布氏桿菌 (Br.Bovis)是一類革蘭氏陰性短小桿菌，可引起母畜傳染性流產。布魯氏菌是一種細胞內的細菌病原體引起全球人畜共患病布魯氏菌病。布魯氏菌毒力依賴于它的能力過渡到宿主細胞內的細胞內的生活方式。因此，這種病原體必須檢測其細胞內的定位，然后重新在宿主細胞內調整基因表達。在牛布氏桿菌的研究方面，利用免疫蛋白質組學技術篩選布魯菌高免疫原性膜蛋白作為DNA疫苗的免疫抗原候選分子是預防此病的新途徑(Roset，2013[24])。郭振華(2009)[25]對牛種布魯氏菌弱毒疫苗株s19與構建株Δs19全菌蛋白的比較蛋白質組進行了研究；趙永坤等(2012)[26]對感染牛布魯菌544A的巨噬細胞蛋白質組學進行了分析。

3.4 蛋白質組技術在牛其他臨床疾病上的研究

學者們分別對奶牛乳熱癥蛋白質組學(夏成,2010[27])；蹄葉炎奶牛蛋白質組學(Sun,2013[28])；結核桿菌蛋白質組學(陸曄 等，2011[29])，學者們利用雙向電泳與免疫印跡相結合篩選牛支原體免疫相關蛋白質組(陳維 等，2012[30])；脲酶B亞單位疫苗免疫對奶牛血清蛋白質組分的影響(袁廷杰 等,2012[31])等方面做了深入的研究和探索。Bouasria (2013)[32]研究了黏膜表面的逆境脅迫誘導表達控制系統(SICE)在乳酸乳球菌的治療性分子機制。奶牛酮病是一種常見的代謝性疾病。已知的診斷標記酮癥，如丙酮和β-羥基丁酸(BHBA)，但疾病預測仍然是一個難題。Matthias(2012)[33]研究奶牛得酮癥的致病的機理。通過對患有酮病奶牛的牛奶蛋白質組學的研究，發現在整個哺乳期，高甘油磷酸膽堿GPC與低酮病的發病率高度相關，并指出牛奶GPC與磷酸膽堿(PC)的比是一種可靠選擇健康奶牛的指標。犢牛運輸過程中，患肺炎和腹瀉是造成死亡的主要原因，袁廷杰 等(2012)[34]對運輸前后奶牛血清蛋白質組進行了研究。Senthilkumaran et al.(2013)[35]收集了162頭運輸后犢牛的支氣管肺泡灌洗液(BALF),較低水平的膜聯蛋白A1和A2是斷奶和運輸育肥牛肺炎的易感性增加的潛在生物標志物。手足口病是一種高度傳染性的病毒性疾病，野生的和家養的偶蹄類動物。口蹄疫病毒與宿主細胞之間的復雜關系，導致它的復制和傳播。 BHK-21細胞系是一個口蹄疫病毒感染的體外模型，通常用于制備病毒種子。為了更好地理解這種關系的分子基礎，Zhang(2013)[36]對感染口蹄疫病毒的幼倉鼠腎細胞蛋白質組學進行了研究，結果質譜確定了30個蛋白點改變(19個上調，下調2個病毒蛋白質斑點)，其中包括蛋白質代謝過程，細胞骨架蛋白微絲相關蛋白，應激反應蛋白和口蹄疫病毒蛋白。 Western blot分析進一步證實NME - 2蛋白在蛋白質組的配置文件的差異表達。亞細胞定位證明NME2蛋白分布在BHK -21細胞的細胞質和細胞核上。

4 展望

生命科學是需要證明的實驗性科學，生命科學的發展依賴于實驗技術的發展。雖然MS-蛋白質組學開始走向成熟，并開始了通過儀器，樣品制備和計算分析相結合的多元發展模式，但蛋白質組學仍需要技術的突破來推動蛋白質組學的發展[37]。目前，還沒有與核酸擴增的PCR技術相似的蛋白質擴增技術，對微量蛋白質的檢測仍是問題。另一方面，單一學科很難詮釋蛋白質間復雜的、動態的、連續的互為因果的關系。如何對這一龐大、抽象，又富于變化的問題加以分析，西方科學發展的經典過程是將復雜的事物加以分割并建立不同的模型，用不同學科各自的學科工具對某一特定變化的細節問題加以研究，再用比較方法加以分析。當這些研究積累到一定程度和深度時，再已某些理論為基礎用系統的思想提出因果的假設，在不斷的篩選、重復驗證的過程中，提出假說對事物的變化進行解釋。把一個學科的經典理論引入到另一個學科中加以研究，往往會得到一個嶄新的領悟。例如19世紀Hermann von Helmholtz 在他的能量代謝研究中引入了熱力學第一定律，為我們對生物體內能量平衡的研究奠定了理論基礎，改變了相應領域的研究思路。為此，不難看出新理論、合理假設的提出相比研究技術的創新要更能引領了相應學科的發展。 隨著學科的發展，學科分支越來越細。蛋白質組學為我們提供了完全嶄新的思路直接運用系統生物學思想綜合運用各學科理論，從整體上研究生命現象。個人的力量是有限的，需要多學科的學者共同的努力，建立以國家、各學科為單位的開放的、發散的，具有創新意識的研究團隊或組織機構并開展技術交流。

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