內皮一氧化氮合酶(eNOS)基因與藏雞低氧適應機制的研究

劉玲燕,蘭 茜,朱 慶

(四川農業大學“畜禽遺傳資源發掘與創新利用四川省重點實驗室”，雅安 625014)

內皮一氧化氮合酶(eNOS)基因與藏雞低氧適應機制的研究

劉玲燕,蘭 茜,朱 慶*

(四川農業大學“畜禽遺傳資源發掘與創新利用四川省重點實驗室”，雅安 625014)

內皮一氧化氮合酶(eNOS)作為調控血管舒張因子NO生成的限速酶，對維持機體NO平衡和適應低氧環境具有重要作用。長期生活在高海拔低氧地區的藏雞，形成了一套獨特的低氧適應機制。作者就eNOS基因結構、編碼產物特征和功能進行了綜述，并對藏雞eNOS基因參與低氧適應的遺傳機制進行探討，以期為家禽起源、進化、育種等工作提供借鑒。

藏雞；低氧適應；NO；eNOS

藏雞(Tibetan chicken)是全世界生活在高海拔地區歷史最長的雞種，它具有耐粗飼，抗病力強，肉味美，蛋營養價值高等特點，是中國高海拔地區發展養雞業不可缺少的品種，是開發西藏優質、特色禽產品的良好資源[1]，其機體已經形成了低氧適應的遺傳機制。內皮一氧化氮合酶(endothelial NO synthases，eNOS)在低氧適應機制中發揮重要的作用，低氧可通過轉錄水平、翻譯水平和翻譯后水平多種模式調節eNOS的功能[2]。eNOS主要分布在脈管系統的內皮組織，它的結構包括N端的氧化結構域和C端的還原結構域，只有兩個eNOS單體形成活性的異二聚體結構才能催化L-精氨酸生產NO[3]。在生理條件下由eNOS產生的少量NO能夠維持生物體正常的生理功能，包括血管緊張度，血壓，血管平滑肌細胞的增殖和抑制血栓形成等[4-5]，同時，研究表明低氧會刺激機體產生更多的eNOS和NO[6]，以增大呼吸量，調節血壓和氧含量，這可能是eNOS的表達量與低氧適應有關的主要原因。對藏雞eNOS基因的研究有助于為家禽起源、進化、育種等工作提供借鑒。

1 eNOS 基因及其編碼產物

eNOS在不同物種中位于不同染色體上，人類的eNOS(NC_000007.13)位于7號染色體；家鼠的eNOS(NC_000071.6)位于5號染色體，雞的eNOS(NC_006089.3)位于2號染色體，全長10.7 kb，通過可變剪接可形成7個獨特的mRNA轉錄本(JQ434754.1、JQ434755.1、JQ434756.1、JQ434757.1、JQ434758.1、JQ434759.1、JQ434760.1)，其長度在3 000 bp左右；其中的一個轉錄本1(JQ434754.1)長度為3 310 bp，起始密碼子和終止密碼子分別位于281—283 bp和3 236—3 238 bp，編碼合成985個氨基酸殘基，蛋白質相對分子質量約為110 ku；哺乳動物中，eNOS基因核酸序列和蛋白質序列相似性分別為86%～99%和91%～99%。而雞的eNOS的cDNA序列和蛋白質序列與哺乳動物序列相比分別有72%～77%和71%～72%的相似性[7]。

內皮型一氧化氮合酶是一氧化氮合酶(NO synthases ，NOS)家族的成員之一，NOS共有4個亞型，包括神經元型NOS(neuronal NO synthases，nNOS)、內皮型NOS(endothelial NO synthases，eNOS)，誘導型NOS(inducible NO synthases，iNOS)和線粒體NOS(mitochondrial NO synthases，mtNOS)。以哺乳動物為例說明功能結構域，N端是一個包含亞鐵素、L-精氨酸和四氫生物嘌呤(tetrahydrobiopterin，BH4)結合位點的氧化酶域(氨基酸1-491)，C端是一個含黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和鈣調素(calmodulin，CaM)結合位點的一個還原酶域(氨基酸492—1 205)[8-9]。在NO合成中，還原酶域中的NADPH得到電子，并轉給其余的電子受體，最終通過FMN再轉給氧化酶域的亞鐵素，亞鐵素得到電子后，能夠綁定O2并刺激L-精氨酸產生NO[10]。

2 eNOS的高海拔適應功能

周錦等[11]的研究表明敲除eNOS基因(eNOS-/-)的小鼠顯示出低氧肺血管結構重塑和肺動脈高壓，而吸入NO能有效地緩解這些癥狀[12]；轉入eNOS基因的轉基因小鼠不僅可以抑制由低氧引起的肺動脈壓增高，也可以抑制由低氧引起的肺小血管結構重塑[13]。具有eNOS缺陷的小鼠也更容易患高海拔水腫。有研究者發現，在高海拔肺水腫病人中，NO的水平減少，而藏人、艾瑪拉人[14]和拉達克人[15]在他們呼出的氣體和循環血液中具有較高水平的NO。此外，在對日本民眾的研究發現，高海拔肺水腫易感性與eNOS的多態性有關[16]。這些研究支持了高水平的NO和eNOS具有高海拔的適應作用，同時也表明了對低氧的敏感性是有遺傳基礎的。此外，相較于健康雞，飼養在高海拔的患肺動脈高壓雞的肺組織eNOSmRNA轉錄量和肺動脈內皮細胞eNOS的表達都更低，而較低的eNOS表達與平滑肌增厚有關[17]。

3 eNOS 基因在藏雞低氧適應性中的研究進展

eNOS基因的研究已涉及生長、代謝以及病理學等領域，隨著eNOS在低氧適應中的重要作用逐漸被人們接受，人們也對藏雞的低氧適應機制進行了探索。

盡管來自人類、小鼠、牛、豬和其他哺乳動物的eNOS基因的cDNA序列在20世紀末已經被克隆，但是雞的eNOS基因直至2012年才被完全鑒定或克隆。作為調節血管舒張素NO生成的限速酶，eNOS基因在其低氧適應中發揮著重要作用。研究表明，低氧條件下，低地雞與藏雞胚胎孵化過程中不同組織的eNOS的mRNA表達豐度存在差異，這可能與藏雞的低氧適應有關[7]。

3.1 藏雞呼吸系統eNOS與低氧適應機制的研究

胚胎發育是一個動態的過程，它不僅僅由生物體遺傳背景決定，還由所處的環境決定[18]。通過比較在低地飼養的藏雞和壽光雞的胚胎eNOS的 mRNA表達發現，無論是低氧還是常氧，藏雞肺組織中eNOS的表達顯著高于壽光雞[7]。此外，張浩等[19]研究也表明，在低氧條件下，藏雞和低地雞的肺組織eNOS酶活力比生活在低海拔時明顯增加；但無論在低海拔還是在高海拔時，藏雞eNOS酶活力都比低地雞高，尤其在高海拔，差異更加明顯。同時，H.Zhang等[20]研究了低氧對孵化性能的影響，結果表明，具有不同低氧適應遺傳背景的藏雞和矮小型雞，在2 900 m海拔上孵化，無論是孵化率，胚胎重還是雞重，藏雞都比矮小型雞高出一倍；補充O2后，矮小型雞的孵化率大大提高。說明O2不足是導致低地雞在2 900 m海拔孵化率低和小雞質量差的主要因素，藏雞肺組織eNOS酶的高表達和高活力可能是其適應低氧的重要因素之一。

3.2 藏雞血管系統eNOS與低氧適應機制的研究

在血管系統中，雖然eNOS一直被認為主要存在于血管內皮細胞，但是后來P.Kleinbongard等[21]運用免疫熒光聚焦顯微鏡、WB等方法，證實了人的每個紅細胞中都存在eNOS蛋白，而且在紅細胞功能中發揮重要作用，并證實了eNOS蛋白存在于細胞膜內面和細胞液。這一發現使eNOS的定位得到補充，同時對eNOS在氧運輸和血液動力學方面開辟新的領域。不過eNOS的mRNA是否在紅細胞中表達仍存在爭議[22]。而無論是藏雞還是低地雞，紅細胞中是否存在eNOS的表達，還未曾見報道。

藏雞和低地雞血液生理生化指標的研究可能解釋eNOS在紅細胞中的存在。張浩等[23]研究表明，與矮小隱形白羽肉雞相比，藏雞的血液體積、紅細胞體積和血漿體積都更低，可能說明了雞紅細胞中存在eNOS蛋白且藏雞紅細胞中的eNOS酶活力比低地雞強；但是也有許多生活在高海拔的動物具有更高的血液體積或紅細胞體積的報道[24-25]，這是否表明了鳥類與哺乳動物在血液生理方面具有不同的低氧適應機制還有待證實。在低氧刺激下，藏雞血液紅細胞數目升高，平均紅細胞體積降低，紅細胞的表面積擴大，更有利于血紅蛋白綁定氧，提高血紅蛋白運輸氧的效率；同時也可能是低氧刺激紅細胞中eNOS蛋白增加，血管擴張，更有利于對低氧的適應。飼養在高海拔的藏雞能一直維持高水平的紅細胞數目和穩定的血細胞比容值，而飼養在高海拔的矮小隱形白羽肉雞隨著年齡增長，紅細胞數和血細胞比容逐漸增加。這些結果表明在低氧環境下，藏雞擁有高水平的紅細胞數量是遺傳適應機制，而矮小型隱形白羽肉雞增加的紅細胞數量是對低氧的生理補償性反應。其他研究也證實了藏雞在遺傳上具有更高的靜脈CO2含量，血紅蛋白濃度和血氧親和力及更低的靜脈pH值，這些血液生理指標是藏雞對低氧的生理適應[26-27]。以上這些血液特點是否與eNOS的表達有關，還需要進一步研究確定。

4 結 語

總之，藏雞能夠適應高海拔低氧的環境是整個機體各系統的協調合作完成的，包括呼吸系統和血液循環系統。藏雞各器官組織eNOS的表達特性可能是其在低氧環境生存的有利憑證。

藏雞長期生活在高海拔地區，與外界的基因交流較少，形成了一套獨特的遺傳基礎。雖然對其低氧適應機制的研究也在不斷開展，但是研究的力度還遠遠不夠。在哺乳動物中eNOS的結構、作用機制、病理學等領域的研究較多，較深入，但是在藏雞中的研究程度還顯得比較單薄。鑒于其低氧適應機制的研究晚于哺乳動物，其研究發展空間還很大，今后還需要對此進一步深入探討，尤其是對eNOS基因的進化及其分布的探討具有很大的研究價值。

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(編輯 白永平)

The Research of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene in Hypoxia Adaptation of Tibetan Chicken

LIU Ling-yan，LAN Xi，ZHU Qing*

(FarmAnimalGeneticResourcesExplorationandInnovationKeyLaboratoryofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

As rate-limiting enzyme of regulating Nitric Oxide (NO) generation，endothelia nitric oxide synthase (eNOS) plays an important role to maintain the balance of NO，which is a vasodilatation factor.Life for a long time in high altitude hypoxic regions of Tibetan chicken，formed a unique mechanism of hypoxia adaptation.In this paper，the structure ofeNOSgene，coding product features and functions were reviewed，meanwhile，eNOSgene of Tibetan chicken involved in genetic mechanism of hypoxia adaptation are discussed，in order to provide help for the researches of origin，evolution，breeding of poultry，etc.

Tibetan chicken；hypoxic adaptation；NO；eNOS

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.003

2014-06-18

劉玲燕(1989-)，女，四川南充人，碩士生，主要從事家禽遺傳育種與繁殖方面的研究，E-mail:liulingyan_602@163.com

*通信作者：朱 慶，E-mail:zhuqing5959@163.com

S813.1

A

0366-6964(2015)02-0192-04