腸神經嵴干細胞發育與先天性巨結腸關系研究

尚 卿綜述，劉遠梅審校（遵義醫學院附屬醫院小兒普胸泌外科，貴州遵義563099）

腸神經嵴干細胞發育與先天性巨結腸關系研究

尚 卿綜述，劉遠梅審校
（遵義醫學院附屬醫院小兒普胸泌外科，貴州遵義563099）

干細胞； 腸神經系統； Hirschsprung??； 胚胎發育； 綜述

先天性巨結腸（HD）也稱為先天性腸無神經節細胞癥，是小兒外科常見的消化道畸形，普遍認為其主要發病機制與胚胎時期腸神經嵴干細胞（ENCCs）遷移、發育、存活異常有關[1]，且與造成正常腸神經系統（ENS）發育異常有關。HD的發病機制尚未完全明了，國內外均對其發病原因進行了大量研究，普遍認為，ENCCs發育異常是HD發病的主要原因之一，現將影響ENCCs發育的因素綜述如下，進一步探討HD的病因。

1 ENCCs的正常發育形成完整的ENS

ENCCs起源于迷走神經和骶神經的胚胎軸區域。迷走神經嵴細胞最終定植在前腸、中腸和后腸，而骶神經嵴細胞遷移定植到遠端腸管。在小鼠胚胎，迷走神經嵴細胞于胚胎8.5 d開始遷移，于胚胎14.5 d結束，遷移大約需6 d[2]；在人類胚胎，ENCCs的遷移于胚胎4周時開始，結束于胚胎7周，大約花費3周[3]。最開始普遍認為，ENCCs必須通過盲腸部分可定植于后腸。但Nishiyama等[4]對小鼠胚胎ENCCs延遲成像的研究顯示，胚胎10.5～11.5 d，中腸和后腸呈反向平行，這時，ENCCs可通過二者間的腸系膜以單細胞的形式從中腸遷移至后腸，并且這些通過腸系膜遷移的ENCCs是組成后腸ENS的主要來源。此外，有研究表明，ENCCs定植到腸管各處后并非是一動不動的，單個細胞存在一個無目的的遷移[5]，甚至有由遠端向近端，呈相反方向的遷移運動，這種現象可能是ENCCs在腸管內保持密度均勻的一種機制。另外，有學者認為，小鼠胚胎10.5～14.5 d存在一個限制期，當ENCCs未及時通過腸系膜遷移時，后腸的定植就會受到影響。但Barlow等[6]研究表明，即使胚胎14.5 d后也存在ENCCs的定植，這說明可能不單只有一個控制ENCCs遷移的限制期。目前，單純的遷移延遲已經不能完全闡明HD的發病機制，而且ENS的形成也不單單只受到ENCCs增殖、分化的影響，還受到腸道內環境的影響[7-8]。無論ENCCs在哪一環節上出現異常，都將導致ENS的發育缺陷，進而可能引起HD發生。

2 影響ENCCs發育的腸道內遺傳學因素

2.1 受體酪氨酸激酶（RET）和膠質細胞源性神經營養因子（GDNF） RET和GDNF是引起HD最主要的基因。在散發HD病例中（家族成員中只有1例HD患者）RET基因的突變率達15%～35%，而家族病例中達50%。GDNF是一種分泌蛋白，與GDNF家族受體α1（GFRα1，一種錨定在細胞表面的磷脂酰肌醇糖基化的蛋白）結合形成復合物，可以結合并激活跨膜RET。然后RET自身磷酸化激活下游通路，從而調節ENCCs增殖、存活、凋亡、遷移和分化。

在ENCCs遷移進入胚腸前，GDNF在中胚層即有表達。當其遷移入胚腸時，即開始表達RET和GFRα1；當ENCCs到達食道位置時，GDNF已經在胃表達；而當ENCCs遷移至遠端小腸時，GDNF已經在盲腸表達[8]，表明GDNF的作用可能是促進RET和GFRα1的表達，使ENCCs遷移至正確位置，如果后腸無GFRα1表達的話，ENCCs則不能離開中腸。近期，一種新的RET基因突變小鼠，表現為ENCCs通過腸系膜從中腸遷移至后腸時發生延遲和破壞，引起腸神經節細胞減少癥[4]，這說明RET對ENCCs跨腸系膜遷移也起到調節作用。但需要注意的是，ENCCs遷移的延誤或數量的減少并不會必然導致腸道神經節細胞的缺如，其不足的細胞數可以通過局部神經嵴細胞的增殖和分化來代償[6-7]。無論基因突變是在RET、GDNF或GFRα1任何一處，只要GDNF-GFR α1-RET復合體功能缺陷，就可能導致無神經節細胞癥。

2.2 內皮素通路 內皮素因子3（EDN3或ET3）是一種腸道間質細胞分泌的多肽，可以與內皮素B型受體（EDNRB）結合，并通過內皮素轉換酶1（ECE1）的修飾形成只有21個殘基大小的活性形式。EDN3-EDNRB信號通路參與調節ENCCs的正常遷移并維持腸神經干細胞的增殖狀態[9]，抑制ENCCs的分化。

EDN3基因、EDNRB基因和ECE1基因突變小鼠均表現出不同程度的ENCCs遷移缺陷，造成遠端腸管ENS的缺如。對EDNRB的進一步研究發現，在條件性敲除EDNRB基因的研究中發現，EDN3-EDNRB信號通路的關鍵期在胚胎10.5～12.5 d，而且EDNRB缺失和EDN3缺失小鼠只在遠端結腸上表現為腸無神經節細胞癥，推測EDN3-EDNRB信號通路可能在神經節細胞遷移的后期起重要作用。在正常小鼠的胚胎14.5 d，ENCCs已經完全遷移至整個小鼠腸道，而對于EDNRB突變小鼠，ENCCs的遷移較正常小鼠要晚24 h，而且ENCCs遷移方向改變的同時速度也降低[10]。最近，Evangelisti等[11]研究發現，載脂蛋白B（ApoB）是GDNF/RET

和EDN3/EDNRB通路調控ENCCs的一個新靶點，可能與ApoB介導腸管內Hu蛋白D型（HuD）蛋白的表達有關，這為將來進一步研究ENCCs的特性提供了新的著手點。

2.3PHOX2B基因 PHOX2B基因可以編碼一種與神經發育有關的轉錄因子，在ENCCs遷移過程中、腸神經元和膠質細胞中均有表達[12]。PHOX2B基因缺失的小鼠和斑點魚動物模型表現為全腸段的無神經節細胞癥[13]，且在該突變小鼠的無神經節腸管內無RET的表達。在人體中，多聚丙氨酸延展突變是PHOX2B基因最常見的突變類型，臨床表現為先天性中樞性肺換氣不足綜合征（CCHS），同時合并有HD的發生，且丙氨酸延展越長，其HD表型也越嚴重[14]。其發生機制可能與PHOX2B基因和SOX10基因之間互相調節失衡，導致自主神經節發育異常有關[15]。

2.4 SOX10基因 SOX10基因也是一種轉錄因子，迷走神經嵴細胞從神經管內遷出時可表達SOX10，在ENCCs遷移過程中持續表達，并維持ENS前體細胞的活性。SOX10純合突變的小鼠表現為ENS和黑色素細胞的異常，這種小鼠“ENS前體細胞池”的細胞數相較正常小鼠明顯減少，且整個腸道均缺乏神經元細胞。迷走神經嵴細胞在遷移入腸前就已經死亡，所以該突變小鼠一出生就將死亡。人類SOX10基因突變表現為瓦登伯革綜合征，無神經節細胞癥就是其中一種表型。Nagashimada等[15]在研究“CCHS-HD-神經細胞瘤”聯合動物模型時，通過引入一個重復擴展突變的基因至小鼠的PHOX2B基因表位，使得突變胚胎腸道神經節前體中SOX10基因持續表達，降低了ENCCs的擴增和向膠質細胞分化的能力。說明SOX10基因和PHOX2B基因的相互調控可能是維持ENCCs向神經元和膠質細胞定向分化的關鍵。Watanabe等[16]將SOX10基因突變小鼠和整合素β1（ITGB1）基因突變小鼠雜交后發現，SOX10基因的過多或過少表達同樣會影響ENCCs的定植能力，原因可能是SOX10基因表達的改變影響了整合素β1亞單位（一種重要的細胞外基質受體）的表達有關。這同樣也說明細胞外環境的改變，也將會影響ENCCs的遷移、定植。

2.5 CXCR4基因 CXCR4是基質細胞衍生因子1（SDF-1）的特異受體，位于細胞表面，表達于血管內皮細胞。CXCR4基因敲除小鼠表現為胃腸道大血管的形成缺陷，同時，這些小鼠在胚胎11.5 d通過腸系膜遷移的ENCCs數量減少，且在胚胎14.5 d相較于正常小鼠定植于后腸的ENCCs顯著減少[4]，暗示經腸系膜遷移的ENCCs可能受到血管源性信號通路的部分影響。但最近Delalande等[17]認為血管網絡的發育對ENCCs的遷移無引導作用，甚至從最開始二者間就是獨立存在的，因此血管源信號通路與HD的關系仍需進一步研究。

2.6DNA甲基轉移酶3B（DNMT3B）DNMT3B是哺乳動物體內的DNA重新甲基化酶之一，在建立和維持個體DNA甲基化模式的過程中起到了非常重要的作用。盡管已有研究證明，DNMT3B與顱ENCCs的發育無關[18]，但Torroglosa等[19]于體外分離培養HD患者和健康人的ENCCs后發現，后者ENCCs神經球的DNMT3B基因mRNA及蛋白表達量較健康組明顯下降，而Nestin（一種神經干細胞標記物）的表達較健康組明顯增高，這說明HD患者的ENCCs分化能力也相應下降。同時，其研究還證實，HD患者ENCCs的FN1基因、LAMC1基因及PAX6基因表達也顯著下調，而PAX6低表達會降低細胞增殖能力[20]，高表達將促進神經細胞的分化[21]。可以看出，異常的DNA甲基化模式可能調節ENCCs的發育，參與HD的發病，對DNMT3B聯合其他HD相關基因的研究也將進一步闡明HD的病理機制。

3 影響ENCCs發育的腸道內局部微環境因素

目前普遍認為，HD為一多基因異常導致的疾病，但遺傳學因素尚不能完全闡明HD的發病，大多數學者認為，腸道內局部微環境的改變也可影響ENS的正常發育。腸道神經節細胞是由ENCCs發育而來，而局部微環境的改變影響ENCCs的正常遷移及分化，是HD發生的主要非基因學病因之一。

3.1 維生素A 維生素A（又稱視黃醇）是一種人體必需的維生素，其活性形式維甲酸（RA）在胚胎發育中起重要作用。不足或過量地攝入維生素A均會導致胎兒先天缺陷，甚至造成死胎。最近研究顯示，敲除RBP4基因小鼠模型和敲除RALDH2基因小鼠模型[22]可能為HD的發病機制提供新的方向。該2種小鼠的肝臟不能保存維生素A，在胚胎7.5 d時開始對孕鼠行無維甲酸飲食，胎鼠將完全耗盡維生素A及維甲酸。RBP4基因缺陷小鼠表現為輕度的維甲酸缺乏伴遠端腸管神經節細胞缺失癥，同時存在磷酸酶的增高和張力蛋白同源物（PTEN）的聚集，后者的堆積將降低ENCCs的遷移速度。因此，RA被認為可能通過維持ENCCs遷移過程中偽足的形成，從而保持ENCCs的持續遷移。這也表明，維生素A的缺乏可能是引起HD的非遺傳危險因素。RALDH2基因缺陷小鼠通常于胚胎9.5 d左右死亡，早于ENS的發育。但是，如果從胚胎7.5 d開始對孕鼠添加維甲酸飲食處理，則胎鼠存活的時間大大延長，同時也表現出腸神經節細胞發育不良。盡管上述的小鼠模型表明，維甲酸信號通路可能參與HD的發病，但無論哪種基因缺陷小鼠，其HD的表現均存在部分人為干預的因素，因此維甲酸對ENCCs遷移的具體機制仍有待探索。

3.2 骨形成蛋白（BMPs） BMPs屬于轉化生長因子β（TGF-β）超家族，是一種廣泛的調節因子，對胚胎期的細胞增殖、分化、凋亡和器官發育上均起作用。已有研究指出，BMPs及其相關的信號分子在ENCCs遷移及ENS神經節形成過程中起作用[23]，最近發現低濃度的BMPs可提高神經元數量，反之，高濃度的BMPs會減少腸道神經元的數量，可能與BMPs限制腸道神經前體細胞的增殖有關。Wu等[24]實驗發現，在HD患者狹窄段腸管，BMP2、BMP5、BMP10表達顯著增加，說明這些蛋白與HD的發生有密切關系。但目前BMPs引起HD的具體機制尚不清楚，對其更深的研究可能會為治療HD提供一個新靶點。

3.3 細胞粘合素C（TNC） TNC也叫肌腱蛋白C，是一種細胞外基質蛋白。Akbareian等[25]發現，在禽類胚胎發育過程中，當ENCCs到達盲腸區前，幾乎不表達TNC。一旦ENCCs通過盲腸進入后腸時，就會在ENCCs周圍大量表達。其進一步研究表明，ENCCs自身也產生TNC，而這種細胞外基質蛋白通過修正局部的內環境促進其遷移能力。此外，只有迷走神經嵴來源的ENCCs表達TNC，而骶神經嵴來源的ENCCs不表達這種蛋白，其原因尚不明了?？梢圆孪耄咛テ谠摰鞍妆磉_異常將會影響正常ENS的發育，成為HD發生的危險因素之一。

綜上所述，HD是一個復雜的疾病，其遺傳機制也異常復雜，且胚胎期腸道微環境的異常也參與了HD的發病。雖然已有大量的針對HD病因的研究，但單純的遺傳學原因不能完全解釋HD的發病機制，仍需進一步研究探索更多HD相關的遺傳和非遺傳因素。對于HD患者基因外顯子甚至是整個基因組序列的檢測，可能是一種理想的方式來確定是哪些基因的突變會引發HD。同時，對于腸道微環境及環境因素對ENS的影響也不能忽略。腸神經干細胞移植治療HD一直被認為可能是一種徹底治愈HD的理想方法，目前已有將患者自身提取的腸神經干細胞進行基因修飾后移植治療HD的報道[26]，因此研究新的HD動物模型、更深入的篩選、鑒定與HD發病有關的人類基因，并嘗試去發現這些基因突變后對ENS的影響，也將對未來HD的臨床診斷、治療，甚至對高危人群的HD預防起到積極作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.016

：A

：1009-5519（2015）08-1164-04

2014-12-05）

貴州省科學技術基金項目（黔科合J字[2012]2364號）。

尚卿（1990-），男，河南新鄉人，碩士研究生，主要從事小兒普外科臨床工作；E-mail：pal40276292@163.com。

劉遠梅（E-mail：yuanmei116@aliyun.com）。