蛇床子素對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用及機制研究

楊 欣,曾興建,付 娟

蛇床子素對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用及機制研究

楊 欣,曾興建,付 娟*

目的 探討蛇床子素(Osthole，Ost)對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的急性肺損傷的作用及其機制。方法 45只雄性C57小鼠隨機分為3組：正常對照組(對照組)，LPS組，Ost+LPS組(Ost組)，每組15只。各組小鼠于腹腔注射LPS或生理鹽水(50 mg/kg)6 h后，測定PaO2、PaCO2、pH，IL-6、IL-1β、TNF-α表達，JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達量，觀察肺組織病理變化和濕干比(W/D)。結果 與LPS組比較，Ost組PaCO2、W/D，IL-6、IL-1β和TNF-α表達，p-JAK2和p-STAT3蛋白表達量和肺組織病理改變均明顯降低，但PaO2和pH增高，而JAK2和STAT3表達無明顯變化。結論 Ost預處理可通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活而減輕LPS誘導的急性肺損傷。

蛇床子素；脂多糖；急性肺損傷；炎癥；JAK2/STAT3

0 引言

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)及其發展到嚴重階段的急性呼吸窘迫綜合征是由嚴重創傷、燒傷、感染等肺內外疾病誘發的以肺細胞彌漫性損傷為主要表現的全身性炎癥反應，是臨床上常見的急性危重癥，嚴重威脅人類健康[1-2]。蛇床子素(Ost)是一類從傘行植物中分離出來的天然豆香化合物，研究發現其具有廣泛的藥理生物學治療作用，如抗炎、抗腫瘤、抗過敏等[3-5]。而炎癥是急性肺損傷重要發病機制之一[1,6]。本實驗利用脂多糖構建小鼠急性肺損傷模型，探討Ost對急性肺損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 蛇床子素(純度98%，西安易樂)，LPS(Sigma：美國)，3%戊巴比妥鈉(谷歌生物，武漢)，JAK2(CST，美國)，p-JAK2(CST，美國)，p-STAT3(CST，美國)，STAT3(CST，美國)，β-actin(abcom，美國)。TRIzol reagent(Invitrogen,美國)，逆轉錄試劑盒(GeneCopoeia，美國),SYBR green(Takara，日本)，IL-6、IL-1β和TNF-α RT-PCR引物(擎科生物技術有限公司,序列見表1)，IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒購自于eBscience，HE試劑由三峽大學醫學院病理實驗室配制。紫外分光光度計(Thermo fisher)、逆轉錄儀(Eppendorf),RT-PCR儀(BIO-RAD IQ5)、顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(HITMAS-30)由三峽大學醫學院病理科實驗室臨床病理組提供。

1.2 實驗動物及分組 45只雄性健康C57小鼠，體重20～25 g，SPF級，購自北京華富康實驗動物中心，質量合格證號：410703012，飼養于三峽大學醫學院實驗動物中心，許可證號：HYXK(鄂)20130257，設施使用證明號：013451。適應性喂養1周后，狀態良好，小鼠隨機分為正常對照組(對照組)、脂多糖組(LPS組)和Ost+脂多糖組(Ost組)，每組15只。Ost組于LPS注射前連續給予Ost(40 mg/kg)4 d灌胃，LPS組給予LPS(50 mg/kg)腹腔注射，對照組腹腔注射生理鹽水，劑量參考文獻[7]。

1.3 標本收集和血氣與濕干比檢測 各組小鼠在LPS或生理鹽水注射后6 h，在3%戊巴比妥鈉局麻下行腹主動脈取血，取1 mL做血氣分析，其余室溫下3 000 r/min離心10 min后取上清液。開胸取左肺，用PBS沖洗2次，濾紙吸干表面血水后稱定濕重，然后將其置80 ℃烘烤約48 h至恒重后稱定干重，計算肺濕重/干重比(W/D)。W/D代表肺含水量，評定肺水腫。右肺1/3放入中性甲醛溶液，其余2/3肺組織凍于-80 ℃冰箱。

1.4 肺臟病理檢測 置于中性甲醛溶液的右肺固定24 h后，70%乙醇脫水、修塊、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察并評分[7]。0分(沒有損傷)；1分(輕度損傷)：間質水腫和局限性壞死；2分(中度損傷)：廣泛的肺臟細胞腫脹和壞死；3分(嚴重損傷)：有血管濃縮和肺臟萎縮和壞死；4分(極嚴重損傷)：彌漫性血管濃縮，出血和肺臟壞死。

1.5 Western blot分析 提取肺組織蛋白，采用BCA法進行定量，取60 μg樣品進行SDS-PAGE分析，電泳結束后立即電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入目標一抗JAK2(1∶2 000)、p-JAK2(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶500)、β-actin(1∶3 000)單抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應HRP標記的二抗室溫孵育1 h，滴加ECL發光，暗室顯影，掃描膠片，進行灰度分析。

1.6 Western印跡檢測 取肺組織于精微天平稱重，按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液(以1∶50加入50×cocktail)，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質的上樣量，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(5%濃縮膠，10%分離膠，恒壓80～100 V)后轉膜(PVDF膜，恒流300 mA)，然后洗膜，以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h、JAK2(1∶2 000)、p-JAK2(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶500)、β-actin(1∶3 000)單抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，Kodak化學發光儀曝光顯示目的蛋白，并拍照。以Quantity one對條帶進行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結果。

1.7 實時定量PCR(RT-PCR)檢測IL-6、TNF-α和IL-1β 稱取100 μg肺組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計測量濃度，逆轉錄以及擴增反應按試劑盒說明書進行。以管家基因β-actin作為內參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計算相對表達量。結果見表1。

表1 實時定量PCR檢測的引物序列

1.8 ELISA檢測血清IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測收集的血清上清液中IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平。

2 結果

2.1 Ost預處理對肺組織結構的影響 LPS刺激6 h后，與對照組比較，LPS組小鼠肺部有大量炎性細胞浸潤(中性粒細胞和巨噬細胞)，肺組織間隙可見大量紅細胞滲出及肺泡壁增厚，彌漫性毛細血管擴張、充血伴灶性肺泡內出血，血管周圍出現富含蛋白的水腫液形成水腫套。Ost組與LPS組比較，炎癥細胞浸潤、紅細胞滲出及肺泡壁增厚、毛細血管充血擴張、充血及水腫明顯減少。顯示Ost預處理可以明顯減少LPS對肺臟組織結構的損傷。見圖1。

圖1 對內毒素誘發的急性肺損傷病理結構影響(HE染色，200×)

2.2 Ost對急性肺損傷小鼠肺濕重/干重比(W/D)的影響 LPS刺激6 h后，LPS組與對照組比較，肺W/D值明顯增加(P<0.01)，提示急性肺水腫明顯加重；與LPS組比較，Ost組W/D明顯降低(P<0.05)，提示Ost預處理能有效地減輕LPS引起的小鼠急性肺水腫。見圖2。

圖2 Ost對LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺W/D的影響

2.3 Ost對LPS誘導的ALI小鼠血氣的影響 與對照組比較，LPS組PaCO2明顯增加，PaO2和pH值明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；Ost組PaCO2明顯低于LPS組，而PaO2、pH值明顯高于LPS組。結果顯示Ost預處理可以明顯降低LPS誘發的血氣改變。見圖3。

圖3 Ost對LPS誘發的ALI小鼠的血氣改變的影響

2.4 Ost預處理對JAK2/STAT3信號通路的影響 WB檢測顯示，LPS組與對照組比較，p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，但JAK2和STAT3表達水平差異無統計學意義。Ost組與LPS組比較，p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，但JAK2和STAT3表達差異無統計學意義(P>0.05)，顯示Ost預處理可以抑制LPS誘發的JAK2/STAT3信號通路激活，見圖4、圖5。

圖4 WB檢測Ost預處理對JAK2蛋白表達的影響

圖5 WB檢測Ost預處理對STAT3蛋白表達的影響

2.5 Ost預處理對促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達的影響 RT-PCR檢測顯示，LPS組與對照組比較，TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平明顯提高，但Ost預處理后，Ost組與對照組比較，TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平明顯降低。顯示Ost預處理可以減少LPS誘發的促炎癥細胞因子的表達。見圖6。

2.6 Ost預處理對促炎癥細胞因子分泌的影響 ELISA檢測顯示，LPS組與對照組比較，TNF-α、IL-6和IL-1β分泌水平明顯增加，Ost組與急性肺損傷組比較，TNF-α、IL-6和IL-1β分泌水平明顯降低。顯示Ost預處理可以抑制LPS誘發的促炎癥細胞因子的分泌。見圖7。

圖6 RT-PCR檢測Ost預處理對促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達的影響

圖7 ELISA檢測Ost預處理對促炎癥細胞因子分泌的影響

3 討論

急性肺損傷及其繼發的急性呼吸窘迫綜合征是一種失控的級聯式炎癥反應，肺血管內皮細胞和上皮細胞彌漫性廣泛損傷，進而引起肺功能嚴重受損，甚至多器官功能損害，誘發多器官功能衰竭，嚴重影響健康[1-2]。其治療方法有限且不良反應較多[1-2]，因此迫切需要尋找相關的治療藥物。

Ost又名歐芹酚甲醚，為傘形科一年生草本植物蛇床的果實。最近研究發現，Ost具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗凋亡、抗腫瘤的功效[3-6]。而炎癥是急性肺損傷重要的發病機制[3-5]。

本實驗利用LPS誘導小鼠急性肺損傷，急性肺損傷的小鼠組可見大量炎性細胞浸潤(中性粒細胞和巨噬細胞)，肺組織間隙可見大量紅細胞滲出及肺泡壁增厚，彌漫性毛細血管擴張、充血伴灶性肺泡內出血，血管周圍出現富含蛋白的水腫液形成水腫套，PaCO2、W/D明顯升高，PaO2、pH明顯降低，促炎癥細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達明顯增加。而Ost組炎癥細胞浸潤，紅細胞滲出及肺泡壁增厚，毛細血管充血擴張，PaCO2明顯降低，而PaO2、pH明顯升高，W/D明顯升高，促炎癥細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達明顯減少，顯示Ost預處理可通過抑制促炎癥因子信號通路的激活而減輕急性肺損傷。

JAK2/STAT3信號通路是經典的信號通路，在炎癥調節過程中起重要作用[8-9]。實驗證實，急性肺損傷能夠激活JAK2/STAT3信號通路，Ost預處理可以抑制JAK2/STAT3激活，因此推測Ost可通過抑制JAK2/STAT3信號通路而減輕促炎癥反應，進而減輕急性肺損傷。但在急性肺損傷中，除抑制JAK2/STAT3信號通路外，Ost是否還可作用于其他信號通路有待進一步研究。

本研究表明，Ost預處理可以減輕LPS引起的急性肺損傷，為臨床預防治療急性肺損傷提供了新的新思路。

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Protective effect of osthole on LPS-induced acute lung injury in mice and its mechanism

YANG Xin,ZENG Xing-jian,FU Juan*

(Yichang Second People′s Hospital,Hubei 443000)

Objective To investigate the protective effect of osthole (Ost) on LPS-induced acute lung injury in mice and its mechanism.Methods 45 male C57 mice were randomly divided into three groups:control group (control),LPS group(LPS),andosthole+LPS group (Ost).PaO2,PaCO2and pH,the expression of pro-inflammatory cytokines IL-6,IL-1β and TNF-α in lung tissue and serum,the protein level of JAK2,STAT3,p-JAK2 and p-STAT3 in lung tissue,the pathological change and Wet/Dry after 6 h of LPS or saline injection of the mice were examined.Results Compared with LPS group,PaCO2and Wet/Dry,the expression of pro-inflammatory cytokines IL-6,IL-1β and TNF-α in lung tissue and serum,the protein level of JAK2,STAT3,p-JAK2 and p-STAT3 in lung tissue and the pathological changes in lung tissues significantly decreased,and PaCO2,pH and Wet/Dry increased.Moreover,the protein expression level of JAK2 and STAT3 had no significant difference.Conclusion Ost pretreatment can protect mice against LPS-induced acute liver injury by suppressing JAK2/STAT3 signal pathway.

Osthole;LPS;Acute lung injury;Inflammation;JAK2/STAT3

2015-01-21

宜昌市第二人民醫院，湖北 宜昌 443000

宜昌市科學基金(A11301-38)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508004

*通信作者