正交實驗法優選補腎化瘀浸膏的水提取工藝

歐陽露，段雪梅，李洪亮，劉 明，劉 英，汪選斌*

正交實驗法優選補腎化瘀浸膏的水提取工藝

歐陽露1,2，段雪梅2，李洪亮1,2，劉 明1,2，劉 英1,2，汪選斌1,2*

目的 優選補腎化瘀浸膏的最佳水提取工藝。方法 采用L9(34)正交實驗法，以干膏得率、淫羊藿苷和柚皮苷含量為考察指標，以提取時間、提取水量、提取次數為考察因素，篩選最佳水提取工藝條件。結果 最佳提取工藝為：藥材加8倍量水，提取3次，每次1 h。結論 該提取工藝科學合理，穩定可靠，可行性佳，可作為實際生產提取工藝。

補腎化瘀浸膏；正交實驗；水提取工藝

0 引言

補腎化瘀浸膏處方由淫羊藿、骨碎補、熟地、當歸、地鱉蟲五味藥材組成，實驗研究證實，該方具有補腎壯骨、活血止痛之功效，對原發性骨質疏松癥有良好的治療作用，具有很高的臨床應用和開發價值[1-3]。本實驗在前期實驗的基礎上，進一步考察補腎化瘀浸膏的水提取工藝，使其制備工藝更加科學合理，從而保證其臨床應用的安全有效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-20A系列高效液相色譜儀：工作站LC solution，LC-20AD泵，SIL-20A自動進樣器，SPD-M20A檢測器。分析天平(FA2004型,上海天平儀器廠)。超聲波清洗機(KQ3200型,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 淫羊藿、骨碎補、熟地、當歸、地鱉蟲(5味藥材均由湖北醫藥學院附屬人民醫院中藥房提供)，淫羊藿苷、柚皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:200415、201111)，甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 正交實驗設計 根據藥材性質和實際生產要求選取提取水量(A)、提取時間(B)以及提取次數(C)為因素，正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平

2.2 干膏得率的測定 稱取處方量藥材共9份，每份48 g，按L9(34)正交表進行實驗，提取液濃縮至100 mL，靜置放冷后稱量其質量。取正交實驗提取液，搖勻，分別量取50 g，置于干燥至恒重蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，然后至干燥器中冷卻30 min，迅速用分析天平精密稱定質量，計算干膏得率，干膏得率=干膏質量/原藥材質量×100%。

2.3 淫羊藿苷、柚皮苷含量測定[4]

2.3.1 色譜條件及系統性試驗 色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；梯度洗脫，流動相：磷酸水溶液(0.2% H4PO3，pH=2.9)-乙腈(0～13 min體積分數為77%，13～20 min體積分數為67%，20～35 min體積分數為77%)，檢測波長為269 nm，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，各峰的理論塔板數不低于5 000。

2.3.2 溶液的制備 對照品溶液配制：分別取淫羊藿苷及柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL約含0.3 mg的淫羊藿苷和0.12 mg的柚皮苷溶液，搖勻即得。樣品溶液的制備：精密稱取上述提取液約20 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL后精密稱定重量，超聲提取30 min，靜置放冷至室溫，精密稱定質量，以甲醇補足損失重量，濾過，續濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。陰性對照品溶液的制備：按處方和工藝制法分別制備不含淫羊藿和骨碎補的陰性樣品，再按“樣品溶液的制備”方法制得陰性樣品溶液。

2.3.3 淫羊藿苷、柚皮苷的含量測定 精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，用外標兩點法計算含量，色譜圖見圖1。

2.4 實驗結果 見表2。以干膏得率、淫羊藿苷與柚皮苷含量的綜合評分作為指標，根據各指標對提取工藝的影響程度賦予不同的權重系數，綜合評分=(干膏得率隸屬度×0.4+淫羊藿苷隸屬度×0.3+柚皮苷隸屬度×0.3)×100%[5]。以多指標實驗公式法統計分析P值為考察指標，由表2中極差R值大小，判斷各因素作用的主次，作提取工藝方差分析綜合得出最佳水提取工藝。方差分析結果見表3。

圖1 補腎化瘀浸膏HPLC色譜圖

表2 正交試驗結果

極差大小分析顯示，以各指標的綜合評分為考察指標，影響水提取效果的順序為C>B>A，且C3>C2>C1，B2>B3>B1，A3>A1>A2。方差分析結果顯示，因素C(提取次數)有顯著影響，而因素A(提取水量)、因素B(提取時間)沒有顯著影響。結合實際生產中考慮到節約成本和時間，確定最佳提取工藝為A1B1C3，即用8倍的水量提取3次，每次提取1 h。

表3 方差分析結果

2.5 驗證實驗 稱取處方量藥材共3份，每份48 g，按照優選的最佳提取工藝：提取水量8倍，提取時間1 h，提取次數3次進行提取實驗。按照上文所述進行干膏得率測定、淫羊藿苷及柚皮苷含量測定，計算得出驗證實驗結果。驗證實驗結果見表4。結果顯示該工藝重復性好，穩定可行。

表4 驗證實驗結果

3 討論

本研究中的補腎化瘀經驗方在臨床以水煎劑使用，前期動物實驗得出的對原發性抗骨質疏松癥的治療作用也是使用水煎劑，且方中主要的有效成分水溶性較好，因此采用水提法作為該浸膏的提取方法。淫羊藿苷和柚皮苷分別是方中主藥的有效成分，具有明確抗骨質疏松的藥理作用[6-7]，因此，選擇檢測淫羊藿苷和柚皮苷的含量作為提取工藝的考察指標。中藥提取工藝的考察如以單一指標成分作為考察指標難以體現中藥效應整體性的特征，本實驗選擇以淫羊藿含量、柚皮苷含量以及干膏得率共同作為該制劑提取工藝的考察指標，根據各指標對提取工藝影響的程度不同，賦予不同的權重系數，進行加權綜合評價，使所考察提取工藝更加科學合理。

綜上所述，本研究結果表明，優選出的水提取工藝科學合理，穩定可靠，操作簡單，可行性佳，可作為實際生產提取工藝。

[1] 歐陽露,汪選斌,國宏莉,等.補腎化瘀浸膏對去勢大鼠骨密度及骨組織形態的影響[J].醫藥導報,2009,28(12):1533-1535.

[2] 歐陽露,汪選斌,肖雨清,等.補腎化瘀浸膏對去勢大鼠血清ALP、E2及IL-6水平的影響[J].中國藥師,2009,12(10):1342-1344.

[3] OUYANG L,ZHANG QF,WANG XB,et al.The treatment effect of Bushenhuayu extracts on osteoporosis in oophorectomized Rats[J].Exp Ther Med,2014,7(6):1687-1690.

[4] 歐陽露,夏鵬,李洪亮,等.高效液相色譜法同時測定補腎化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量[J].醫藥導報,2014,33(9):1224-1226.

[5] 李云雁,胡傳榮.試驗設計與數據處理[M].第2版.北京:化學工業出版社,2008:134-137.

[6] Pei LK,Sun SQ,Guo BL,et al.Fast quality control of Herba Epimedii by using Fourier transform infrared specroscopy[J].SpectrochimActa Part A,2008,70( 2):258-264.

[7] 彭雙,韓立峰,王濤,等.骨碎補中的化學成分及藥理作用研究進展[J].天津中醫藥大學學報,2012,31(2):122-125.

Optimization of extraction process for bushenhuayu extracts with orthogonal test

OUYANG Lu1,2,DUAN Xue-mei2,LI Hong-liang1,2,LIU Ming1,2,LIU Ying1,2,WANG Xuan-bin1,2*

(1.Laboratory of Chinese Herbal Pharmacology,Renmin Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China；2.School of Pharmacy,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;)

Objective To optimize the aqueous extraction process for bushenhuayu extracts (BSHY).Methods L9(34) orthogonal experiments were conducted to choose the optimal conditions by using naringin and icariin as quantitative index.The factors included time,volume of water,frequence of extraction.Results The optimal conditions were 8 fold volume of water with 1 h per time for three times.Conclusion The method of extraction is reasonable,stable and relatively ideal to extract the active ingredients of BSHY for its real preparation.

Bushenhuayu extracts;Orthogonal test;Aqueous extraction process

2015-01-06

1.湖北醫藥學院附屬人民醫院中藥藥理實驗室，湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院藥學院，湖北 十堰 442000

湖北省教育廳項目(B2015487)；湖北省2011協同創新中心基金(4)；湖北省自然科學基金面上項目(2014CFB642)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508020

*通信作者