丹參酮ⅡA納米粒對肝癌小鼠p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表達的影響

田鋒奇, 張文周, 趙秀莉

(鄭州大學附屬腫瘤醫院 藥學部, 河南 鄭州, 450003)

論著

丹參酮ⅡA納米粒對肝癌小鼠p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表達的影響

田鋒奇, 張文周, 趙秀莉

(鄭州大學附屬腫瘤醫院 藥學部, 河南 鄭州, 450003)

摘要:目的觀察丹參酮ⅡA納米粒對肝癌小鼠p38有絲分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、轉化生長因子β1(TGFβ1)及細胞周期素E (Cyclin E)蛋白表達的影響。方法60只小鼠制備肝癌模型后隨機分為6組，分別給予生理鹽水以及等體積的空白納米粒、丹參酮ⅡA、不同劑量丹參酮ⅡA納米粒。觀察各組腫瘤抑制率及p38MAPK、TGFβ1、Cyclin E蛋白的表達。結果各給藥組瘤體質量均較對照組顯著縮小(P<0.01), 且高劑量組腫瘤抑制率顯著高于丹參酮ⅡA 組及低劑量組(P<0.01); 給藥后各給藥組p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E陽性表達率均顯著高于或低于對照組及空白載體組(P<0.01), 各劑量丹參酮ⅡA納米粒組與丹參酮ⅡA組差異顯著(P<0.01), 且隨著劑量增加，表達水平呈現逐步升高或降低趨勢，組間差異顯著(P<0.01)。結論丹參酮ⅡA納米粒較丹參酮ⅡA具有更顯著的抗腫瘤功效，可能與上調p38MAPK蛋白表達，下調TGFβ1及Cyclin E蛋白表達有關。

關鍵詞:肝癌; 丹參酮ⅡA; 納米粒; 轉化生長因子β1; p38有絲分裂原活化蛋白激酶; 細胞周期素E

肝癌在中國具有較高的發病率，但手術切除率僅為20%左右。p38有絲分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是MAPK家族的成員之一，介導細胞的生長、分化、分裂及凋亡等過程，與腫瘤的發生發展密切相關[1-3]。轉化生長因子β1(TGFβ1)對細胞增殖具有重要的調控作用，且可激活p38等多種MAPK。細胞周期素E(Cyclin E)是G1期細胞增殖信號蛋白，其高表達可以縮短G1期，誘發腫瘤。丹參酮ⅡA是丹參的主要有效成分之一，對多種癌細胞具有殺傷作用，但丹參酮ⅡA不溶于水，這對其臨床應用造成較大阻礙。納米粒載藥系統具有良好的緩釋性和靶向性，近年來得到廣泛應用[4-5]。本研究觀察了丹參酮ⅡA納米粒對肝癌小鼠p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表達的影響，現報告如下。

1材料與方法

1.1　動物和瘤株

雄性清潔小鼠60只，體質量18～22 g, 購自河南省實驗動物中心；小鼠肝癌H22細胞株由鄭州大學附屬腫瘤醫院實驗室保存。

1.2　藥物和試劑

丹參酮ⅡA購自成都瑞芬思生物科技有限公司，丹參酮ⅡA納米粒由本院制備，載藥量為1.8%, 兔抗鼠p38、TGFβ1、Cyclin E單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，免疫組化及DAB試劑盒購自深圳市科潤達生物工程有限公司，倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3　方法

1.3.1肝癌模型制備：將凍存的瘤株復蘇，培養至對數生長期后，接種于小鼠腋下(濃度為1×107/mL), 腫瘤生長至1 cm時進行原位移植，方法如下：在無菌狀態下剝取癌組織，切片備用。小鼠麻醉后常規消毒，手術暴露肝葉，沿其平面制作一條大約2 mm深的隧道，將剝取的癌組織送入其中，止血后縫合腹部切口。

1.3.2分組及給藥方法：造模后12 d，將小鼠隨機分為對照組8只，空白載體組10只，丹參酮ⅡA組9只、丹參酮ⅡA納米粒低劑量組11只、中劑量組10只及高劑量組12只，分別尾靜脈注射生理鹽水25 mL/kg、空白納米制劑125 mg/kg、丹參酮ⅡA 2 mg/kg、丹參酮ⅡA含量分別為1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg的丹參酮ⅡA納米粒。1次/d, 連續給藥1周，末次給藥24 h后，處死小鼠。

1.3.3檢測方法：以免疫組化法檢測相關蛋白表達，石蠟切片包埋，抗原修復后加入非免疫性動物血清50 μL, 室溫孵育10 min后，滴加單克隆抗體過夜，PBS溶液沖洗3 min×3次，加入生物素化羊抗兔IgG，孵育30 min后PBS沖洗。DAB溶液顯色，流水沖洗。蘇木素復染，脫水后固定。

1.4　觀察指標

比較各組瘤體質量及腫瘤抑制率差異；觀察腫瘤組織中p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白陽性表達率的差異。

1.5　判定標準

腫瘤抑制率判定：處死小鼠后取出腫瘤組織稱重，腫瘤抑制率=(對照組平均瘤體質量-治療組平均瘤體質量)/對照組平均瘤體質量×100%。

蛋白陽性表達判定：以細胞核或細胞質呈棕黃或棕褐色判斷為陽性細胞，每張切片由2名經驗豐富的病理醫師雙盲閱片，于高倍鏡下任選10個視野，計數陽性細胞數，陽性表達率=(表達陽性細胞數/總細胞數)×100%。

2結果

2.1　各組瘤體質量及腫瘤抑制率比較

經統計學分析，空白載體組瘤體質量與對照組無顯著差異(P>0.05), 其余各組均較對照組顯著縮小(P<0.01), 且隨著丹參酮ⅡA納米粒劑量增加，瘤體質量呈現減輕趨勢，組間差異顯著(P<0.01), 等劑量的丹參酮ⅡA納米粒組較丹參酮ⅡA組瘤體質量顯著減少(P<0.01)。見表1。丹參酮ⅡA組、低、中、高劑量丹參酮ⅡA納米粒組的抑瘤率分別為63.54%、65.33%、72.94%、82.56%，其中高劑量組顯著高于丹參酮ⅡA組及低劑量組(P<0.01)。

±s)　g

與對照組比較，**P<0.01;

與丹參酮ⅡA組比較，##P<0.01;

與丹參酮ⅡA納米粒低劑量組比較，△△P<0.01;

與中劑量組比較，▲▲P<0.01。

2.2　各組腫瘤組織中p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表達特征及陽性率比較

p38MAPK主要在細胞質或細胞核中表達，TGFβ1及Cyclin E蛋白主要在細胞核中表達，呈棕黃色或棕褐色。見圖1。各給藥組p38MAPK陽性表達率均顯著高于對照組及空白載體組(P<0.01)，各劑量丹參酮ⅡA納米粒組均顯著高于丹參酮ⅡA組(P<0.01)，且隨著劑量增加，表達水平呈現逐步升高趨勢，組間差異顯著(P<0.01); 各給藥組TGFβ1及Cyclin E陽性表達率顯著低于對照組及空白載體組(P<0.01), 各劑量丹參酮ⅡA納米粒組均顯著低于丹參酮ⅡA組(P<0.01), 且隨著劑量增加，表達水平呈現逐步降低趨勢，組間差異顯著(P<0.01)。見表2。

A.p38MAPK表達;B.TGFβ1表達;C.CyclinE表達圖1 各指標蛋白表達特征

±s)　%

與對照組比較，**P<0.01; 與丹參酮ⅡA組比較，##P<0.01; 與丹參酮ⅡA納米粒低劑量組比較, △△P<0.01;

與中劑量組比較，▲▲P<0.01。

2.3　相關性分析

經Pearson相關性分析, p38MAPK與TGFβ1表達呈負相關(r=-0.595,P<0.01), 與Cyclin E之間無顯著相關性。見圖2。

圖2 p38MAPK與TGFβ1表達相關趨勢圖

3討論

丹參酮ⅡA為中藥丹參提取物，研究表明，其對乳腺癌、肝癌、胃癌、白血病等多種腫瘤細胞具有細胞毒性作用，具體抗腫瘤機制可能包括[6-7]: ① 抑制DNA合成，從而抑制腫瘤細胞增殖; ② 調節細胞周期，延長細胞周期中G0/G1比例，從而抑制腫瘤細胞增殖; ③ 上調p53等凋亡相關基因的表達，促進腫瘤細胞凋亡; ④ 抑制bcl-2等原癌基因表達，從而抑制腫瘤細胞增殖; ⑤ 下調血管內皮生長因子、細胞分裂促進因子的表達等，抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡。丹參酮ⅡA的水溶性較差，較大程度上限制了其生物利用度及在抗腫瘤領域的臨床應用，因此，尋求合適的載藥系統對提高其生物利用度具有重要意義。納米粒是抗腫瘤等多種藥物的理想載體，具有較好的可降解性及生物相容性[8-9], 近年來越來越多地應用于丹參酮ⅡA的制備。

p38MAPK是MAPK家族成員之一，細胞外多種應激原均可引發該家族的連鎖反應，影響細胞內基因轉錄和蛋白合成等生物學效應，多種抗癌藥誘導腫瘤細胞凋亡均通過活化p38MAPK實現。目前認為p38MAPK可能通過增強c-myc表達、磷酸化p53、參與Fas/FasL介導的凋亡通路等途徑，實現誘導細胞凋亡的目標[10]。王炎等[11]研究認為，p38MAPK可誘導人肝癌細胞株SMMC-7721凋亡，延緩細胞周期，其機制可能是通過p38MAPK信號轉導通路上調凋亡相關基因表達來實現。TGFβ1/Smads信號轉導通路是調控細胞增殖的重要系統，是機體抗腫瘤的關鍵環節。研究表明，肝癌發生發展過程中存在著該信號轉導通路異常引起的細胞異常增殖及凋亡障礙。李琦等[12]研究表明, TGFβ1能夠抑制小鼠肝癌生長，延長生存期，可能與其上調p38MAPK表達并抑制TGFβ1表達有關。Cyclin E是細胞G1向S期過度的調節因子，在生長信號的刺激下，細胞內Cyclin E蛋白表達上調，轉化為活化的復合物狀態，促進轉錄及DNA復制。Cyclin E蛋白過表達的腫瘤患者生存率顯著低于低表達患者，因此其可作為腫瘤預后的預測因子。研究表明, Cyclin E在肝細胞肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，且分化越差、臨床分期越晚，其表達水平越高[13]。

本研究結果表明，各給藥組小鼠的瘤體質量均較對照組顯著減輕，提示丹參酮ⅡA及其納米粒均有確切的抗腫瘤功效，而丹參酮ⅡA納米粒的效果更加顯著，這可能與納米粒載藥系統具有更好的靶向性、緩釋性，從而有效提高藥物的生物利用度有關；同時，本研究發現丹參酮ⅡA納米粒對p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表達具有顯著調節功能，提示其可能通過上調p38MAPK信號通路、下調TGFβ1及Cyclin E蛋白表達抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡，與上述報道一致。此外，本研究還發現，p38MAPK與TGFβ1的表達呈負相關，但其具體作用機制有待進一步研究證實。

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Influence of tanshinone ⅡA nanoparticles on the

expressions of p38MAPK, TGFβ1and Cyclin E

proteins in mice with hepatic cancer

TIAN Fengqi, ZHANG Wenzhou, ZHAO Xiuli

(DepartmentofPharmacy,TumorHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan, 450003)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the influence of tanshinone ⅡA nanoparticles on the expressions of p38 mitosis mitogen-activated protein kinase (p38MAPK), transforming growth factor β1 (TGFβ1) and Cyclin E proteins in mice with hepatic cancer. MethodsA total of 60 established mice models with hepatic cancer were randomly divided into 6 groups and respectively treated with normal saline and equivoluminal blank nanoparticles, tanshinone ⅡA and different-concentrations of tanshinone ⅡA nanoparticles. Tumor inhibiting rates and expressions of p38MAPK, TGFβ1 and Cyclin E proteins in both groups were observed. ResultsThe tumor body mass decreased significantly in each drug-treated group than in control group (P<0.01), and the high-dose group was significantly higher than tanshinone ⅡA group and low-dose group in tumor inhibiting rate (P<0.01). After drug administration, the positive expression rates of p38MAPK, TGFβ1 and Cyclin E proteins in each drug-treated group were significantly higher or lower than the control group or blank vector group (P<0.01). In addition, there were significant differences between each dose groups and tanshinone ⅡA group (P<0.01), and their expression levels showed gradually increasing or decreasing trend along with the increase of Tanshinone ⅡA dose, and the differences among groups were significant (P<0.01). ConclusionTanshinone ⅡA nanoparticles are more effective than tanshinone ⅡA in treatment of tumor, which is associated with up-regulating the expression of p38MAPK protein and down-regulating the expressions of TGFβ1 and Cyclin E proteins.

KEYWORDS:hepatic cancer; tanshinone ⅡA nanoparticles; transforming growth factor β1; p38 mitosis mitogen-activated protein kinase; Cyclin E

通信作者:趙秀莉, E-mail: hnzhaoxl@126.com

基金項目:中國高校醫學期刊臨床專項資金(11521465)

收稿日期:2015-03-05

中圖分類號:R 735.7

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)11-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201511001