胃癌患者多種高通量譜表達數(shù)據(jù)聯(lián)合分析對相關(guān)基因篩選的臨床價值

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胃癌患者多種高通量譜表達數(shù)據(jù)聯(lián)合分析對相關(guān)基因篩選的臨床價值

李如凱1,郭龍華2

(1.深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院 檢驗科,廣東 深圳518108;2.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院 檢驗科,廣東 深圳518109)

胃癌為臨床上一種常見的惡性腫瘤，占據(jù)所有的惡性腫瘤中較高的比例，為當(dāng)前危害人類生命健康的主要疾病之一。現(xiàn)在，在臨床上仍然沒有明確的胃癌發(fā)病機制，很多學(xué)者認為，胃癌的產(chǎn)生為多基因參與并且是不斷積累的過程，其中涉及到癌基因、生物因子的受體、微衛(wèi)星的不穩(wěn)定以及細胞周期的調(diào)控等諸多改變[1]。對胃癌發(fā)病機制的深入認識有助于提高胃癌的臨床診斷率，為疾病的進一步治療提供重要依據(jù)。本文主要以我院2010年1月至2013年12月50例胃癌患者的胃鏡活檢標(biāo)本為研究對象，分析了采取多種高通量譜表達數(shù)據(jù)聯(lián)合分析并篩選胃癌相關(guān)基因的臨床應(yīng)用價值。具體操作如下。

1資料與方法

1.1　一般資料

回顧性分析選取我院2010年1月至2013年12月50例胃癌粘膜組織胃鏡活檢標(biāo)本。正常胃粘膜組織50例。取樣后迅速置于液氮中備用。

1.2　數(shù)據(jù)分析與RT-PCR方法

采用vNorthern篩查10個已知胃癌基因。在這其中應(yīng)用了腫瘤基因的解剖工程(CGAP)它的數(shù)據(jù)庫中根據(jù)EST數(shù)據(jù)的SAGE-Digital Gene Expression Displayer(SAGE DGED)以及cDNA-Digital Gene Expression Displayer (cDNA DGED)來進行篩查有胃癌的組織和正常的胃組織中的差異表達基因，將上述篩選出的基因進行SAGE vNorthern和EST vNorthern比對，選取在SAGE vNorthern和EST vNorthern數(shù)據(jù)庫中在胃癌組織和正常胃組織中表達具有統(tǒng)計學(xué)差異的基因，與SMD數(shù)據(jù)庫中胃癌微陣列表達譜數(shù)據(jù)進行對比分析，最后選取4個候選胃癌差異基因，采用RT-PCR法進一步在胃癌組織和正常胃組織共100例中進行驗證。

1.3　統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　對于利用vNorthern篩查胃癌相關(guān)基因的可行性分析

采用vNorthern篩查包括PGC、bcl-2、c-met、c-myc、PCNA、GDDR、P53、TFF2、Ha-ras、E-cadherin10個已知胃癌基因。其中：PGC、PCNA、P53、c-met、c-myc、Ha-ras在胃癌組織中表達高于正常組織，E-cadherin在正常組織中表達高于癌組織。GDDR、TFF2幾乎僅在正常胃組織中表達。我們發(fā)現(xiàn)，在vNorthern分析數(shù)據(jù)中，個別基因在部分組織中表達情況和數(shù)據(jù)不符，可能與該數(shù)據(jù)庫收錄數(shù)據(jù)情況有關(guān)。

2.2　數(shù)據(jù)庫cDNADGED和SAGEDGED胃癌差異表達基因篩查

2.2.1cDNADGED胃癌差異表達基因篩查

cDNADGED中進行分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織表達相差≥2倍的基因(前10個)，見表1。從cDNADGED中抽取100個以上的序列文庫，共對比了142個cDNA的文庫，在這其中有胃癌組98個,包括111042個序列，而正常組有44個，共有27889個序列。運用cDNADGED工具進行分析，結(jié)果具有大于2倍差異水平統(tǒng)計學(xué)的意義(P<0.05)的基因247個，其中胃癌組織中高表達的基因92個，低表達的基因155個。

2.2.2SAGEDGED胃癌差異表達基因篩查

SAGEDGED中進行分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織表達相差≥2倍的基因(前10個)，見表2。分析過7個胃組織的短序列標(biāo)簽的SAGE文庫，其中有300741個短序列的標(biāo)簽，胃癌組有4個SAGE文庫其中包括短序列的標(biāo)簽有249310個，而正常組中3個SAGE文庫就有短序列標(biāo)簽共51431個。通過DEGD工具的分析，結(jié)果顯示共有196個標(biāo)簽大于2倍差異水平并且具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，在這196個標(biāo)簽中有69個基因有胃癌組的高表達,還有127個低表達基因。

表1　　cDNADGED中進行分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織

2.3　利用vNorthern來對SAGE DGED以及cDNA DGED進行篩查出胃癌的差異還有表達基因的進一步比對分析

表2　SAGE DGED中進行分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織

通過SAGE vNorthern和EST vNorthern對DNA DGED和SAGE DGED篩選的差異基因進行比對，共篩選出的基因在ESTvNorthern及SAGE vNorthern數(shù)據(jù)中有38個都有統(tǒng)計學(xué)的意義，P<0.05，部分見表3。

表3　vNorthern分析和胃癌組織和正常胃組織部分差異基因

2.4　利用SMD數(shù)據(jù)庫中胃組織微陣列數(shù)據(jù)結(jié)合vNorthern篩查基因進一步比對

將vNorthern篩選得到的38個基因和在SMD數(shù)據(jù)庫中的微陣列的胃組織進行數(shù)據(jù)對比，共研究的胃癌患者有88例以及正常胃組織的23例,經(jīng)過對比分析總共篩選出有一致的差異基因共有9個，正常胃組織見表4。

2.5　ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達分析

ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達分析，見表5。在胃癌組織中，ANXA1的表達顯著高于正常胃組織，而PSCA、AGR2和ANXN1表達顯著低于正常胃組織，P<0.01。

表4　v Northern分析和virtural micrroarray分析共同

表5　ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和

3討論

至今，在臨床上胃癌還沒有一個明確的發(fā)病機制，大多數(shù)的學(xué)者認為，多基因的參與并且逐漸積累就會形成胃癌，其中涉及到細胞周期調(diào)控、癌基因、生長因子的受體、微衛(wèi)星的不穩(wěn)定等諸多改變[2]。對胃癌發(fā)病機制的深入認識有助于提高胃癌的臨床診出率，為疾病的進一步治療提供重要依據(jù)。近年來，在臨床上對胃癌的發(fā)病機制加大了研究的力度，并且還得到了一定的進展。

cDNA文庫以芯片技術(shù)為基礎(chǔ)，是當(dāng)前運用較普遍的一種數(shù)據(jù)庫，當(dāng)前主要芯片數(shù)據(jù)庫包括ArrayExpress數(shù)據(jù)庫、基因表達匯編以及斯坦福微陣列數(shù)據(jù)庫[3]。但是由于芯片技術(shù)發(fā)展時間較短，所傳遞的信息量有限[4]。在實際運用中，具有較高的假陽性率，在腫瘤基因的檢測中具有一定的局限性[5]。SAGE文庫是一種以SAGE技術(shù)為基礎(chǔ)的表達譜數(shù)據(jù)庫。在實際運用過程中，SAGE文庫要求的測序次數(shù)較少，在低豐度的轉(zhuǎn)錄本信息的檢測中，具有較高的靈敏度[6]。相關(guān)研究表明[7,8]，SAGE數(shù)據(jù)庫在胃癌腫瘤差異表達基因的篩選中具有較高的應(yīng)用價值。總之，高通量譜表達數(shù)據(jù)技術(shù)的原理不同，其在腫瘤基因篩選中的敏感性也各不相同，因此，對于胃癌患者胃癌相關(guān)基因的篩選可以聯(lián)合應(yīng)用不同種類的高通量譜表達數(shù)據(jù)技術(shù)，以提高數(shù)據(jù)庫信息挖掘的準(zhǔn)確性，極大程度上降低篩選假陽性率，提高胃癌的診斷準(zhǔn)確性[9]。

本研究通過對100例胃癌患者的活檢標(biāo)本采取多種高通量譜表達數(shù)據(jù)聯(lián)合分析并篩選胃癌相關(guān)基因，結(jié)果顯示，v Northern數(shù)據(jù)分析能篩選出胃癌相關(guān)基因。在cDNA DGED中抽取了100個以上的序列文庫，總共對比的cDNA文庫有142個，其中胃癌組患者有98個,這其中包括了111042個序列，而正常組有44個，總共有27889個序列。通過采用cDNA DGED工具的分析，結(jié)果顯示共有247個基因大于2倍差異水平并且具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，這其中包括有92個高表達的胃癌組織，還有155個基因是低表達，表明cDNA文庫能有效地篩選胃癌相關(guān)基因。分析了SAGE文庫中的7個胃組織短序列的標(biāo)簽，其中共有短序列標(biāo)簽300741個，胃癌組中4個SAGE文庫總共包括249310個短序列標(biāo)簽，在正常組中3個SAGE文庫總共有51431個短序列標(biāo)簽,。通過運用DEGD工具進行分析，結(jié)果顯示共有196個標(biāo)簽大于2倍差異水平并且具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，其中胃癌組高表達的基因69個,低表達的基因127個，表明SAGE文庫有效地篩選胃癌相關(guān)基因。此外，利用SAGE vNorthern和EST vNorthern對DNA DGED和SAGE DGED篩選的差異基因進行比對，在ESTvNorthern以及SAGE vNorthern數(shù)據(jù)中都具有統(tǒng)計學(xué)意義的基因共有38個，P<0.05。將通過vNorthern篩選得到的38個基因和SMD數(shù)據(jù)庫中的胃組織微陣列進行數(shù)據(jù)對比，共研究的胃癌患者有88例以及正常胃組織的23例,經(jīng)過對比分析總共篩選出有一致的差異基因共有9個。在胃癌組織中，ANXA1的表達顯著高于正常胃組織，而PSCA、AGR2和ANXN1表達顯著低于正常胃組織，表明SAGE vNorthern和EST vNorthern有效地篩選胃癌相關(guān)基因，這個結(jié)果于相關(guān)文獻所報道的數(shù)據(jù)是相吻合的[10]。

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(收稿日期：2014-05-27)

文章編號：1007-4287(2015)07-1166-03