枸杞接種尖孢鐮孢菌后抗氧化酶類活性的變化

李 捷,馮麗丹,王有科,何 靜,陳秀蓉,張寶琳

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 林學院,甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；4.甘肅省林業科學研究院，甘肅 蘭州 730020)

枸杞接種尖孢鐮孢菌后抗氧化酶類活性的變化

李 捷1,2,馮麗丹3,王有科2,何 靜2,陳秀蓉1,張寶琳4

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 林學院,甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；4.甘肅省林業科學研究院，甘肅 蘭州 730020)

以枸杞栽培品種寧杞一號和美洲引進野生種L.exsertum為試驗材料，采用切根法接種分離自發病枸杞的強致病菌F.oxysporum，研究接種后0～20 d枸杞葉片中過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)等抗氧化酶的動態變化。結果顯示，接種后L.exsertum的POD，SOD和PAL活性和活性增加量均高于寧杞一號；CAT和PPO活性雖低于寧杞一號，但活性增加量高于寧杞一號，且高酶活持續時間較長，與寧杞一號差異顯著(P<0.05)。接種后SOD和PAL活性的高低，POD、CAT、SOD、PPO和PAL活性的增加幅度均可以作為篩選枸杞抗鐮孢菌根腐病能力的指標。

枸杞；根腐病；Fusariumoxysporum；抗氧化酶類；抗病性

枸杞(Lyciumbararum)為茄科多年生落葉灌木，是重要的“藥食同源”型植物資源之一，具有抗衰老、抗氧化、調節免疫等重要功能，是中國西北地區的特色經濟林，已成為農村重要的經濟來源。近年來枸杞根腐病發病率連年上升，已經嚴重影響到了該產業的可持續發展[1]。1980年枸杞根腐病在西寧市省軍區園藝場成片發生，香日德農場的發病率一度高達53.2%[2]。1994年枸杞根腐病在寧夏普遍發生，最重的病株數37.6%，枯死株26.5%[3]。1998年新疆枸杞主栽區栽植苗木2～3年后死亡率為20%～30%，重者全田被毀[4]。王國珍等[3]1994年報道尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)是寧夏產區枸杞根腐病的最主要的致病菌。近年來對于病原菌與植物互作的研究較多，接種大豆疫霉根腐病菌后，抗病野生大豆比感病野生大豆的SOD活性增大[5]；2013年趙慶芳等[6]研究黃芪接種尖孢鐮孢菌后，黃芪葉中SOD，CAT和POD活性均呈現出先升高后降低的變化規律；韓珊等[7]對板栗不同抗性品種葉片經栗疫菌毒素Cp-處理后發現中抗病品種CAT，APX和PAL活性變化幅度大于感病品種。選用2種枸杞為材料，接種強致病菌F.oxysporum后研究抗氧化酶類活性的變化，以期為西北地區枸杞根腐病抗病栽培和抗病品種選育等提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

枸杞：采用枸杞主栽品種寧杞一號(Ningqi Ⅰ)(感病)和美國的野生種L.exsertum(抗病)，于2014 年在甘肅農業大學林學院森林培育實驗室進行組織培養，煉苗移栽后，選用苗高20 cm的生長健壯均一苗木進行試驗。

病原菌：尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)自甘肅省靖遠縣枸杞產區發病植株分離獲得，經測定是當地枸杞根腐病的優勢菌株且致病性強。在接種前7 d于PDA培養基上活化備用。

1.2 方法

1.2.1 接種方法 取長至滿皿的尖孢鐮孢菌加無菌水制成濃度為106個/mL菌懸液。采取傷根后灌根的方法接種。先用鋒利的刀具在距離苗木2 cm處垂直向下切斷根系至盆底，苗木的4個方向各切一刀；然后將配制好備用的菌懸液每盆澆灌20 mL，每處理接種10盆，以澆灌20 mL無菌水為對照；每處理均重復3次。接種后覆膜、插上編號標簽，黑暗培養24 h后正常光照培養，7 d后去膜，澆灌無菌水保持土壤濕潤。寧杞一號標記為N，接種處理標記為NT，對照標記為NCK；L.exsertum標記為L，接種處理標記為LT，對照標記為LCK。

1.2.2 防御酶類相關指標樣品處理及采樣 接種后立即采樣，然后每4 d在14∶00定時采樣，采集植株中上部的葉片，做成0.2 g混合樣若干，液氮速凍后放入-80℃低溫冰箱內保存備用；接種后0～20 d共采樣6次。

1.2.3 樣品指標測定的方法 隨機抽取樣品進行測試，每個指標重復3 次。超氧化物歧化酶(SOD)活性參照Kyle[8]、Hou等[9]的方法測定；過氧化物酶(POD)活性參照高俊鳳[10]、李合生等[11]的方法測定；過氧化氫酶(CAT)活性參照劉俊[12]、Freguson等[13]的方法測定；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性參照高俊鳳[10]、李合生等[11]的方法測定；多酚氧化酶(PPO)活性參照高俊鳳[10]、鄒琦等[14]的方法測定。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行統計分析。應用SPSS 19.0對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并利用Duncan’s多重比較對差異顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 接種尖孢鐮孢菌后SOD活性的變化

SOD活性變化都呈先上升后下降的趨勢。NT峰值高出NCK 8.79 U/(g FW·min)，LT峰值高出LCK 6.56 U/(g FW·min)，出現峰值的時間分別在第8 d和第12 d(圖1-A)。L.exsertum的SOD活性起始值高于感病品種寧杞一號，差異顯著(P<0.015)。LT的SOD高活性持續到了第20 d，而寧杞一號僅在第12 d之前高于NCK。寧杞一號接種與對照在第12 d之前SOD活性凈增加值為正值，12～20 d為負值，活性下降快；而在0～20 dL.exsertum的SOD活性一直為正值，均值達到了9.8 U/(g FW·min)，極顯著高于寧杞一號(F=4 504.56)。

2.2 接種尖孢鐮孢菌對POD活性的影響

NT與LT的POD活性呈現出先升后降的變化趨勢。寧杞一號POD峰值出現在第8 d，在0～8 d從33.54 μg/(g FW·min)上升為144.06 μg/(g FW·min)，活性上升了4.29倍；8～20 d POD活性下降較快，第20 d時比NCK高11.01 μg/(gFW·min)。L.exsertum的POD峰值出現在第12 d，而寧杞一號的峰值出現在第8 d，0～12 d從10.22 μg/(g FW·min)上升到了117.45 μg/(g FW·min)，活性上升了11.49倍；12～20 d POD活性下降緩慢，高活性持續時間較長，第20 d時高出LCK 57.33 μg/(g FW·min)。0～20 d內NT與NCK之間活性差值平均為7.23 μg/(g FW·min)，而LT與LCK之間為38.53 μg/(g FW·min)，差異極顯著(P<0.01)。但整體為寧杞一號POD活性比L.exsertum強(圖1-B)。

2.3 接種尖孢鐮孢菌對CAT活性的影響

LT與NT處理CAT活性呈現先升后降的變化趨勢。寧杞一號的CAT活性峰值出現在第4 d，最高值達到了165.37 μg/(g FW·min)，是第0 d活性的5.37倍。L.exsertum的CAT活性峰值出現在第8 d，最高值達到了32.11 μg/(g FW·min)，是第0 d活性的7.23倍。寧杞一號達到峰值后迅速下降，而L.exsertum達到峰值后下降平緩，在峰值附近持續時間較長。NT與NCK、LT與LCK的CAT活性的凈增加值分別為9.43 μg/(g FW·min)和12.44 μg/(g FW·min)，L.exsertum大于寧杞一號(圖1-C)。

2.4 接種尖孢鐮孢菌后枸杞PPO活性的變化

2種枸杞PPO活性出現先升后降的變化趨勢，但升降幅度各有不同。LT的PPO活性迅速上升，高活性持續到了第20 d。NT活性的峰值出現在第8 d，高于起始值21.64 μg/(g FW·min)的1.96倍，高出同時段的NCK15.52 μg/(g FW·min)。LT在達到第一個峰值(24.66 μg/(g FW·min)后，直到第20 d較穩定，23.98 μg/(gFW·min)，高出LCK 11.28 μg/(g FW·min)(圖1-D)。比較寧杞一號與L.exsertum在20 d內均值比較發現，NT只在第8 d高于NCK，而LT在所有的時段均高于LCK，上升了69.54%，PPO活性增幅顯著(P<0.05)。

圖1 接種尖孢鐮孢菌后抗氧化相關酶類的活性Fig.1 Changes of antioxidant enzymes activity of inductive reactance Lycium after inoculation with F.oxysporum

2.5 接種尖孢鐮孢菌對枸杞PAL活性的影響

寧杞一號的PAL活性在整個過程中呈現出“降-升-降”的變化趨勢，NT在第8 d時出現PAL酶活高峰，達到了78.22 U/(g FW·min)，隨即下降，第20 d時下降到了與起始值接近的51.28 U/(g FW·min)；NCK的變化比較平緩。L.exsertum的變化復雜，LT的PAL酶活性基本呈現出上升的趨勢，在第20d達到峰值81.49 U/(g FW·min)；LCK的PAL活性波動較小，在第8 d時出現峰值，為72.00 U/(g FW·min)，但很快降至起始值附近。LCK與NCK時PAL活性在0～20 d的活性值均值與起始值相當，差異不顯著。LT與NT的PAL活性均與起始值相比差異極顯著，凈增值分別為5.60 U/(g FW·min)和6.67 U/(g FW·min)。在整個過程中L.exsertum的PAL酶活性要高于寧杞一號(表1)。

表1 接種尖孢鐮孢菌感抗枸杞PAL活性及凈增加值Table1 PAL activity and its net increment of inductive reactance Lycium after inoculation with F.oxysporum U/(g FW·min)

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論與結論

SOD是植物體內專一清除超氧陰離子自由基的酶[15]，接種尖孢鐮孢菌后L.exsertum的SOD活性迅速增強，SOD活性的起始值、峰值以及凈增加值均大于感病的寧杞一號，且差異顯著；研究結果與番茄感染青枯菌[16]、白粉病菌侵染紅三葉[17]、鹽脅迫景天三七結果類似[18]。

POD是植物細胞內源活性氧重要的清除劑[19]，參與植物酚類的氧化與聚合[20]，參與木質素和質保素的合成，降低對胞外酶降解的敏感性，阻止病原物入侵[21]。POD在植物對病原物或逆境因子的抗性中有重要的作用。研究結果顯示，接種尖孢鐮孢菌可以大幅提高抗病L.exsertum的POD酶活性，而抗性較弱的寧杞一號則提高幅度有限，這與前人在小麥抗條銹病研究[22]、大白菜小黑點病[23]研究上結果類似。

CAT作為植物體內存在的重要的抗氧化酶類，在接種尖孢鐮孢菌后L.exsertum在高酶活性下持續時間較寧杞一號長，增加值較寧杞一號高，與不同品種蘋果抗褐斑菌的研究結果相似[16]，而與高粱抗黑穗病和小麥抗條銹菌[24，25]研究結果有差異。

植物通過PPO獲得的抗性可催化形成木質素和其他的酚類物質[26]，可催化形成o-醌，其毒性、黑色素集結以及共價結合修飾親核氨基酸的特性，以抑制致病微生物的繁殖[27]。接種尖孢鐮孢菌后抗病L.exsertum的PPO活性的起始值、峰值以及凈增加值均大于感病的寧杞一號，且差異顯著(P<0.05)，與甘藍鏈格孢菌侵染白菜、黃瓜枯萎菌粗毒素處理黃瓜幼苗研究結果一致[28-30]，與對苜蓿匍柄霉葉斑病[31]的結果則不同。

PAL是苯丙烷途徑的關鍵酶，參與了多種激發子誘導的抗性[32]，增強了植物對病原侵染的抵抗能力[33]。本研究結果顯示，接種尖孢鐮孢菌可以大幅提高L.exsertum的PAL酶活性，而抗性較弱的寧杞一號則提高幅度有限，這與前人在黃瓜[30]、匍匐翦股穎和棉花[34，35]上的研究結果類似。

不論接種尖孢鐮孢菌與否，POD、SOD和PAL在第8 d，CAT、PPO在第4 d均出現了酶活性上升的情況，研究后發現可能與切根接種的接種方法有關，這種接種方式對植株造成的機械損傷引起抗氧化相關酶類的表達，在第8d后對照處理酶活下降回歸正常。

研究結果表明，接種后L.exsertum抗氧化相關酶類POD、CAT、SOD、PPO和PAL酶活性或酶活性增加量高于寧杞一號，且持續時間長差異顯著。說明接種尖孢鐮孢菌后抗病的L.exsertum抗氧化相關酶類被激發，產生了更高的活性，使植物有了更強的抗病能力，表明抗氧化相關酶類在抗枸杞根腐病的過程中具有十分重要的作用。SOD和PAL的酶活性高低，POD、CAT、SOD、PPO和PAL酶活性接種后的增加情況可以作為篩選抗枸杞鐮孢菌根腐病的技術指標。接種尖孢鐮孢菌后，抗病能力強的L.exsertum抗氧化酶類活性激增且持續時間長。這可能與接種處理可以激發植物中的抗性基因表達有關。

[1] 劉淑娟.景泰縣草窩灘鎮枸杞根腐病的發生及防治[J].防護林科技，2009，90(3):116-117.

[2] 劉振榮.枸杞枯萎病研究初報[J].青海農林科技，1980(3):43-45.

[3] 王國珍,魯占魁.寧夏枸杞根腐病病原的研究[J].微生物學通報，1994，21(6):330-332.

[4] 李暉,李國英,付建紅.新疆枸杞爛根病病原的鑒定[J].植物保護學報，1998，25(3):253-257.

[5] 徐鵬飛,鹿文成,靳立梅,等.野生大豆接種大豆疫霉根腐病菌后超氧化物歧化酶活性變化[J].作物雜志,2011(5):31-35.

[6] 趙慶芳,陳玉萍,李巧峽,等.黃芪感染根腐病菌后抗氧化系統的變化規律研究[J].西北師范大學學報(自然科學版),2013,49(2):71-74.

[7] 韓珊,朱天輝.不同抗性板栗品種的防御酶系對栗疫菌Cp-毒素的響應[J].植物保護學報,2009,36(4):305-309.

[8] Kyle M E,Nakae D,Sakaida I,etal.Endocytosis of superoxide dismutase is required in order for the enzyme to protect hepatocytes from the cytotoxicity of hydrogen peroxide [J].J Bio Chem,1988(8):73-84.

[9] Hou Wen-Chi,LuYeh-Lin,Liu Sin-Yie,etal.Activities of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in leaves of different cultivars ofLiriopespicataL.on 10% SDS-PAGE gels[J].Bot Bull Acad Sin，2003(44):37-41.

[10] 高俊鳳.植物生理學實驗技術[M].北京：高等教育出版社，2006.

[11] 李合生,孫群,趙世杰，等.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2000：105-109.

[12] 劉俊,呂波,徐朗萊.植物葉片中過氧化氫含量測定方法的改進[J].生物化學與生物物理進展，2000(5)：548-551.

[13] Freguson I B,Watkins C B,Harman J E.Inhibition by calcium of senescence of detached cucumber cotyledons[J].Plant physiol,1983(1)：182-186.

[14] 鄒琦.植物生理學實驗指導[M].北京：中國農業出版社，1995：97-106.

[15] Schopfer P,Plachy C,Frahry G.Release of reactive oxygen intermediates(superoxide radicals,hydrogen peroxide,and hydroxyl radicals) and peroxidase in germinating radish seeds controlled by light,gibberellin,and abscisic acid.Plant Physiol 125[J].Plant Physiology,2001,125(4):1591-1602.

[16] 王曼.兩個蘋果品種葉片接種褐斑菌后抗病相關酶活性變化研究[D].楊凌：西北農林科技大學,2013.

[17] 劉曉玲,宋超,杜文華.紅三葉對白粉病抗性機理研究[J].草原與草坪,2011,31(3):73-76.

[18] 田曉艷,劉延吉,張蕾,等.鹽脅迫對景天三七保護酶系統、MDA、Pro及可溶性糖的影響[J].草原與草坪,2009(6):11-14.

[19] Rotruck J T,Pope A L,Ganther H E,etal.Selenium:Biochemical Role As A Component Of Glutathione Peroxidasec[J].Nutrition Reviews,2009,38(8):280-283.

[20] Svalheim ?,Robertsen B.Induction of peroxidases in cucumber hypocotyls by wounding and fungal infection[J].PhysiologiaPlantarum,1990,78(2):261-267.

[21] Michiels C,Raes M,Toussaint O,etal.Importance of Se-glutathione peroxidase,catalase,and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative stress[J].Free Radical Biology & Medicine,1994,17(3):235-248.

[22] 姜睿.成株抗條銹小麥品種的篩選及其抗病機理的研究[D].楊凌：西北農林科技大學,2007.

[23] 于業志.大白菜小黑點病及其抗病生理基礎的研究[D].青島：山東農業大學,2007.

[24] 邢慧清.高粱絲黑穗病群體生理指標測定與抗病基因分子標記分析[D].沈陽：沈陽師范大學,2013.

[25] 張彬.小麥抗病基因同源序列分析及條銹菌誘導的防御酶活性研究[D].雅安：四川農業大學,2006.

[26] Thygesen P W,Dry IB,Sp.R.Polyphenol oxidase in potato.A multigene family that exhibits differential expression patterns.[J].Plant Physiology,1995,109(2):525-531.

[27] Thipyapong P,Stetfens J C.Tomato Polyphenol Oxidase(Differential Response of the Polyphenol Oxidase F Promoter to Injuries and Wound Signals)[J].Plant Physiology,1997,115(2):409-418.

[28] 胡穎慧.唐菖蒲根腐菌粗毒素的致毒作用及抗病無性系篩選[D].哈爾濱：東北農業大學,2012.

[29] 王利英,侯喜林,劉琳,等.甘藍鏈格孢菌侵染對白菜保護酶活性和H2O2含量的影響[J].園藝學報,2008(7):1065-1068.

[30] 田雪亮,劉鳴韜,楊家榮.黃瓜枯萎菌粗毒素對不同抗性黃瓜種子萌發及幼苗脅迫作用研究[J].中國生態農業學報,2008(6):1495-1498.

[31] 張靜妮.不同秋眠等級苜蓿匍柄霉葉斑病抗性評價及抗病機理研究[D].北京：北京林業大學,2008.

[32] Mauch-Mani B,Slusarenko A J.Production of salicylic acid precursors is a major function of phenylalanine ammonialyase in the resistance of Arabidopsis to Peronosporaparasitica[J].The Plant Cell,1996(8):203-212.

[33] Whetten R,Sederoff R.Lignin biosynthesis[J].Plant Cell,1995(7):1001-1013.

[34] 馬祥,馬暉玲,安惠惠,等.誘導劑丁二醇對匍匐翦股穎抗病相關的防衛酶活性的影響[J].草原與草坪,2012,32(3):37-42.

[35] 馮潔,陳其煐.棉株體內幾種生化物質與抗枯萎病之間關系的初步研究[J].植物病理學報,1991(4):53-59.

The change of antioxidant enzymes ofLyciumInfected byFusariumoxysporum

LI Jie,1,2，FENG Li-dan3，WANG You-ke2，HE Jing2，CHEN Xiu-rong1，ZHANG Bao-Lin4

(1.CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou，China，730070；2.CollegeofForestryScience,GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou，China，730070；3.CollegeofFoodScienceandEngineering,GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou，China，730070；4.GansuAcademyofForestryScience，Lanzhou，China，730020)

Used the wolfberries,NingqiⅠcv.andL.exsertumas the testing materials,the studying isolated the strong pathogenic that Fusarium oxysporum with root cutting method from the materials,and studied the change of peroxidase,catalase,superoxide dismutase,polyphenol oxidase as well as phenylalanine ammonialyase of leaves from 0 to 20 days after inoculation.The result showed that the enzyme activity,including POD,SOD,PAL and its increment of L.exsertum were higher than that of Ningqi Ⅰcv.The activity of CAT and PPO were lower than that of Ningqi Ⅰcv.,but,the increment of the enzyme activity was higher than that of Ningqi Ⅰcv.and the high enzyme activity had longer time,which had significant difference compared to that of Ningqi Ⅰcv.(P<0.05).The enzyme activity level of SOD and PAL and its increment of POD,CAT,SOD,PPO and PAL after inoculation can be used as a index of screening against root rot with Fusarium of Chinese wolfberry.

Lycium spp.；root rot；Fusariumoxysporum；anti-oxidant enzymes；disease resistance

2015-06-29；

2015-07-13

國家林業局“948”項目(2011-4-29)；甘肅中草藥科技攻關項目(GYC11-01)；甘肅農業大學盛彤笙科技創新基金(GSAU-STS-1338)

李捷(1981-)，男，四川仁壽人，博士研究生，講師，主要從事經濟林抗逆生理和病害防治研究。 E-mail：lj81658@gsau.edu.cn 陳秀蓉為通訊作者。

S 567.23

A

1009-5500(2015)06-0077-06