禽流感檢測技術的研究進展

黃俊姿

烏蘭察布市集寧區動物疫病預防控制中心

禽流感檢測技術的研究進展

黃俊姿

烏蘭察布市集寧區動物疫病預防控制中心

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一種禽類的感染疾病綜合征，不僅會造成巨大的經濟損失，并且嚴重威脅著人類健康。由于流感病毒具有亞型多、抗原變異性較強和宿主范圍廣等特點。因此，建立一種快速、有效的流感病毒檢測方法就顯得非常重要。文章就目前流感病毒的檢測技術，包括診斷做一綜述，為了有效控制禽流感的發生與流行提供有力的技術支撐。

禽流感檢測技術研究進展

一、禽流感概述

1887年，意大利首次發現禽流感，是世界動物衛生組織規定的A類傳染病，中國也已將此病納入一類傳染病［1］。禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起的一種禽類傳染病，雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽均可感染，發病情況差別較大，有的出現急性死亡，有的無癥狀帶毒。根據病毒核蛋白與基質蛋白的抗原性及其基因特性的不同，流感病毒可分為A、B、C型。禽流感病毒屬于A型流感病毒，可感染人、馬和豬及其他哺乳動物，家禽和野生禽類，禽流感一旦暴發往往給養禽業帶來毀滅性的打擊，并且嚴重威脅人類健康。因此，建立一種快速、高效的檢測方法是預防禽流感的重要途徑。

二、禽流感流行病學概括

高致病性禽流感主要病毒亞型為H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N1、H7N3、H7N4和H7N7。其中HPAI的主要特征是突然死亡和高死亡率，可以導致感染禽類的大量死亡。1983年美國澤西州、弗吉尼亞州和賓夕法尼亞州暴發禽流感，共計1250萬只家禽被捕殺；1995年墨西哥發現的低致病性H5N2亞型流行株突變成高致病力毒株，波及12個州，共淘汰1800萬只雞，封鎖3200萬只雞，1.3億只雞被緊急接種疫苗；2003年荷蘭暴發了H7N7亞型的高致病性禽流感，大約有3000多萬只禽類被捕殺；2003年底至2004年初，越南、泰國、韓國和中國等10多個國家相繼暴發H5N1禽流感，在幾個月的時間里，共有一億多禽類死于此種疾病或是被捕殺。

1997年我國香港地區相繼有18人感染H5N1病毒，其中6人死亡，此次感染人的病毒與香港雞場暴發的HPAIV密切相關。2003年我國香港再次發生H5N1直接感染人事件，感染2例，1例死亡。2003年荷蘭Gelderland省暴發高致病性禽流感H7N7，此次AIV暴發中確認的83例，感染者大多數是獸醫和農場工作人員。從1例死于急性呼吸窘迫癥的患者體內分離到H7N7病毒，未發現其他呼吸道病原。特別是2003年12月以來，越南、韓國和日本等亞洲國家先后暴發了大規模H5N1高致病性禽流感，在整個流行期間，越南共有22人確診感染了H5N1高致病性禽流感，其中15人死亡，泰國12人感染，其中8人死亡，在越南還出現了人與人之間傳染禽流感的疑似病例。2007年，印度尼西亞再一次暴發了H5N1高致病性禽流感感染人事件，死亡人數高達64人。AIV作為是否可有引起人類流感大暴發及其對人類健康的潛在威脅［2］是值得研究的熱點問題。

三、禽流感檢測技術

1.病毒的分離鑒定

在無菌條件下采集病料，常規處理后接種9～10日齡的雞胚，收取尿囊液，測定其血凝活性，若結果是陰性則繼續盲傳2～3代。如有血凝活性，則應通過血凝抑制試驗來確定分離的病毒是禽流感病毒、新城疫病毒還是禽腺病毒，如果抗禽流感的血清能抑制血凝現象的話，那樣就證明有禽流感病毒存在。病毒分離鑒定法對禽流感的診斷準確性高，但操作程序繁瑣，耗時費力，因此在臨床診斷上一般不采取這種方法。

2.免疫學診斷技術

（1）瓊脂擴散實驗。其原理是利用可溶性抗原與抗體特異性結合，在瓊脂中擴散形成濃度梯度來檢測AIV群特異性血清抗體的一種試驗方法。禽流感瓊脂擴散試驗簡單易行，既可定性又可定量，但總體而言此法在檢測禽流感抗體水平上的敏感度、準確度較低，易出現假陽性。

（2）神經氨酸酶抑制實驗（NIT）。NIT主要用于禽流感病毒的亞型鑒定，其依據A型流感病毒的表面抗原特性，特別是神經氨酸酶的特性來鑒定流感病毒。

（3）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。用酶標記抗原或抗體，通過顯色反應來檢測相應抗體或抗原的一種方法。本法具有特異、快速、敏感、微量的特點，因此，本法也常用于大批樣品和血清學檢疫。目前，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所已經建立了一系列ELISA方法，如建立了禽流感病毒重組核蛋白ELISA診斷技術、禽流感間接ELISA診斷試劑盒、禽流感Dot-ELISA方法等。

（4）病毒中和試驗。病毒中和試驗只有在抗體與病毒粒子上表面抗原相一致，特別是和吸附到宿主細胞上的病毒一致時，才能取得滿意結果。其敏感性、特異性、檢出率相當高，但操作繁瑣，費時耗力，由于特異性高，所以很多新的檢測方法都以這個方法作為標準來衡量。

（5）血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗。HA和HI試驗是診斷AIV和血清樣品檢疫中最常用的方法之一。由于家禽血清中存在著一些非特異性血凝抑制因子，在HI試驗中常會造成一定數量的假陽性，因此進行HI試驗前，血清樣品除了需滅活外，還應該用高碘酸鈉除去非特異性血凝抑制因子。

3.分子生物學檢測

聚合酶鏈反應（PCR）、反轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）、核酸探針和熒光PCR技術是應用分子生物學技術，以禽流感病毒RNA為檢測目標所建立的一種快速檢測診斷技術，已成功的應用于禽流感病毒的基因檢測和分子流行病學調查。我國最新建立的禽流感病毒熒光RT-PCR診斷試劑盒已獲得新獸藥證書。除了上述已在常規實驗室普遍應用的檢測方法外，核酸依賴擴增技術（NASBA）以及基因芯片等基因診斷技術也在禽流感檢測中發揮作用。

四、結語

控制禽流感需要采取多方面的措施，包括疫苗接種，嚴格的生物安全措施以及建立快速、高效、特異性高的診斷方法。盡管各國科研工作者已經建立了多種診斷禽流感病毒的方法，但是目前尚無一套固定成熟的防治方法。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.3版.北京:中國農業出版社，2010:122-141.

［2］黃京燕，劉宏偉，趙海燕等.禽流感的危害及防控措施［J］.上海訊牧獸醫通訊，2007（1）:55.