地刷子石松提取物對免疫抑制小鼠血清中NO含量及NOS活性的影響*

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地刷子石松提取物對免疫抑制小鼠血清中NO含量及NOS活性的影響*

**通訊作者，E-mail:biner70@sina.com

王嬌，張涵淇，崔圓圓,胡鑫，王德彬**

(中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074)

摘要：目的 研究地刷子石松乙酸乙酯提取物對免疫抑制小鼠血清中一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)活性的影響。方法以環磷酰胺腹腔注射小鼠建立免疫抑制模型，以香菇菌多糖為陽性組，以50、100、200mg/kg的石松乙酸乙酯提取物為實驗組，1次/d，連續給藥10d，末次給藥2h后檢測血清中NO含量及TNOS活性。結果地刷子石松乙酸乙酯提取物能顯著降低小鼠血清中TNOS活性及NO含量。結論地刷子石松乙酸乙酯提取物可能通過抑制小鼠TNOS活力來抑制NO的細胞毒作用，從而增強小鼠的免疫功能。

關鍵詞：地刷子石松；免疫抑制小鼠；一氧化氮；一氧化氮合酶

地刷子石松為含地刷子堿、石松堿及多種三萜類化合物的石松科石松屬植物，其主要用于風濕關節痛、舒筋活絡，此外，它對肺熱咳嗽、肌肉痙攣、跌打損傷、瘡癰腫毒等也有一定的治療作用。關于石松屬植物的免疫調節功能少見文獻報道。大量實驗表明，環磷酰胺可通過抑制小鼠的細胞和體液免疫應答來抑制小鼠的免疫功能。故本實驗以環磷酰胺誘導小鼠建立免疫抑制模型，探討地刷子石松乙酸乙酯提取物對免疫抑制小鼠的免疫調節機制，從而為該類植物的應用和開發提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物昆明種雌、雄小鼠各30只，體質量18～22g，購于武漢生物制品研究所，動物許可證號：SCXK(鄂)2012-0003。

1.1.2藥品及儀器環磷酰胺(阿拉丁試劑有限公司)，香菇菌多糖片(湖北廣仁藥業有限公司，生產批號：131003)，NO試劑盒(碧云天試劑有限公司)，NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)，M200型酶標儀(瑞士TECAN公司)，UV-1800PC紫外可見分光光度計(上海美譜儀器有限公司，生產批號：20141230)。

1.2方法

1.2.1實驗動物處理將60只小鼠隨機分成6組，每組10只，分別為正常組、模型組、陽性給藥組和藥物低、中、高濃度實驗組。除正常組外，其余各組均在實驗的第1、2、3d腹腔注射環磷酰胺溶液(80mg/kg)，正常組在實驗第1、2、3d腹腔注射相同體積的生理鹽水。從實驗第1d起各實驗組灌胃不同濃度(50、100和200mg/kg)的地刷子石松乙酸乙酯提取物，陽性藥組灌胃100mg/kg香菇菌多糖溶液，正常組和模型組灌胃相同體積的生理鹽水。

1.2.2實驗動物取血連續灌胃10d，末次給藥2h后所有小鼠眼眶摘眼球血于無抗凝劑的EP管中，所有血樣于4℃傾斜靜止放置1～2h至血液自然凝固，收集上層分離出的澄清透明的黃色血清。

1.2.3小鼠脾臟指數的測定采取脫臼法處死小鼠，解剖后稱量脾臟重量。計算臟器指數：脾臟指數(mg/g)=脾臟重量/實驗動物體重量。

1.2.4血清中NO含量測定制作NO標準曲線,以NaNO2為標準品，將NaNO2標準品稀釋成0、1、2、5、10、20、50、100、150、200μmol/L梯度濃度的標準溶液，取96孔板，吸取標準溶液50μl,先后加入Griess試劑一、試劑二各50μl，每個濃度的標準溶液設置兩個復孔，用酶標儀測定在550nm波長處的吸光度，并讀取OD值，做回歸曲線，計算回歸方程。再另取一96孔板，孔中加入50μl待測血清，每個血清樣品設兩個復孔，用與前述相同的方法測定OD值。利用回歸方程，計算NaNO2的濃度，換算成血清中NO含量。

1.2.5血清中總NOS活力的測定 根據總NOS試劑盒說明書操作，完成總NOS活力的測定，記錄OD值，計算總NOS活力。

2結果

不同濃度地刷子石松乙酸乙酯提取物對小鼠脾臟指數及血清中NO含量、總NOS活力的影響。如表1所示，地刷子石松乙酸乙酯提取物高濃度組脾臟指數接近于正常組和陽性給藥組，且高、中、低濃度組均與模型組差異顯著，呈劑量依賴關系；地刷子石松乙酸乙酯提取物對小鼠血清中NO含量、NOS活力的影響也與濃度呈正相關，中、高濃度組與正常組相差不大，高劑量組更接近于正常組。

與正常組相比，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001；與模型組相比,*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

3討論

脂溶性小分子NO是機體重要的化合物,能激活靶細胞中的鳥苷酸環化酶，發揮生物學作用。有文獻表明，NO是一種自由基，在動物體內不僅可以發揮抗感染和免疫防疫的生理學作用，還可損傷正常組織或細胞，產生細胞毒性，發揮病理學作用。NO由NOS催化L-精氨酸合成，NOS包括內皮型(eNOS)、神經型(nNOS)、誘生型(iNOS)三種同功酶，降低NOS活力可以抑制NO過量產生。研究表明NO能在免疫系統細胞之間起著信號傳遞的作用[10]。已有實驗[11]表明，在炎癥或免疫抑制的動物模型中，NO濃度顯著高于正常組，產生大量誘導性NO的細胞毒性，在細胞炎癥的病理反應過程中起著主要作用，特征性炎癥癥狀的緩解與NO含量的降低密切相關。

本研究結果表明，模型組血清NO含量及NOS活力與正常組相比，均存在顯著性差異，說明造模成功；陽性給藥組血清NO含量及NOS活力接近正常組，說明陽性藥香菇菌多糖對環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠表現出明顯的恢復作用[12]；地刷子石松乙酸乙酯提取物低、中、高濃度組NOS活力均接近正常組，中、高濃度組NO含量及NOS活力與正常組相比無顯著性差異，且低、中、高濃度組脾臟指數與模型組相比均存在顯著性差異，且高濃度組明顯接近于正常組，說明地刷子石松乙酸乙酯提取物可明顯提高免疫抑制小鼠的免疫功能。另有研究發現，環磷酰胺可使小鼠脾臟萎縮[13]，但本研究結果中環磷酰胺組的脾臟指數明顯高于正常組，這可能與環磷酰胺濃度較高，小鼠脾臟發生代償性增生有關。

綜上所述，地刷子石松乙酸乙酯提取物可能通過抑制血清總NOS活力并最終抑制NO過量產生，降低其對正常組織細胞的細胞毒作用而發揮保護作用，從而提高免疫抑制小鼠的免疫功能，提示地刷子石松乙酸乙酯提取物具有免疫增強作用，且在一定濃度范圍內，其免疫增強作用與濃度呈正相關。

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可能已經受到抑制，造模成功；DEM高劑量組的NO含量、NOS活力雖有升高，但小于DEM中劑量組，說明100 mg/kg的DEM不是建模的最佳給藥量；DEM低劑量組、CY低、中劑量組的NO含量及NOS活力均低于正常組，說明造模不成功。

Effects of the Extract from Lycopodium Japonicum on Serum NO Content and NOS Activity in Immunosuppressed Mice

WANG Jiao,ZHANG Han-qi,WANG De-bin,et al

(CollegeofPharmacy，South-CentralUniversityforNationalities,WuhanHubei430074,China)

ABSTRACT：Objective To explore the effect of the extract from Lycopodium japonicum on serum content of nitric oxide (NO) and the activity of total nitric oxide synthase (NOS) in immunosuppressed mice. Methods The immunosuppressed model was built by intraperitoneal injection with cyclophosphamide.With lentinan as a positive control，the ethyl acetate extract from Lycopodium japonicum was administrated daily for 10 days by gavage at the doses of 50,100 and 200mg/kg，respectively.2 hours later after the last administration，the serum was collected and the NO content and NOS activity were determined.Results The serum content of NO and the activity of NOS in immunosuppressive mice of test groups were significantly reduced as compared to control group.Conclusion The ethyl acetate extract from Lycopodium japonicum can enhance the immunity of mice by inhibiting the activity of NOS and the content of NO.

KEY WORDS：Lycopodium japonicum；Immunosuppressed mice；Nitric oxide；Nitric oxide synthase

(收稿日期：2015-07-10)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2015.06.0463

中圖分類號：R967

文獻標識碼：A

文章編號：2095-4646(2015)06-0463-03

*基金項目：中央高校基本科研業務費專項資金項目(CZY15019)；中南民族大學十二五“民族藥學”國家級實驗教學示范中心項目