術后認知功能障礙動物模型建立及神經行為學研究

錢曉嵐, 王慶端, 張　衛, 周玉冰,

張晶敏2, 江金花3

(1. 河南省直第三人民醫院 麻醉科, 河南 鄭州, 450006; 2. 鄭州大學 藥學院, 河南 鄭州, 450001;

3. 鄭州大學 醫藥科學研究所, 河南 鄭州, 450052; 4. 鄭州大學第一附屬醫院 麻醉科, 河南 鄭州, 450052)

術后認知功能障礙動物模型建立及神經行為學研究

錢曉嵐1,2, 王慶端3, 張衛4, 周玉冰4,

張晶敏2, 江金花3

(1. 河南省直第三人民醫院 麻醉科, 河南 鄭州, 450006; 2. 鄭州大學 藥學院, 河南 鄭州, 450001;

3. 鄭州大學 醫藥科學研究所, 河南 鄭州, 450052; 4. 鄭州大學第一附屬醫院 麻醉科, 河南 鄭州, 450052)

摘要:目的建立術后認知功能障礙動物模型，分析麻醉藥物、手術創傷對小鼠神經行為學影響。方法健康老齡BALB/c小鼠隨機分為空白對照組，麻醉藥物組和手術組。術后第1、3、5、7天行Y迷宮試驗，觀察神經行為學改變，記錄小鼠迷路分辨學習達到學會標準所需要的訓練次數、潛伏期、主動逃避率。結果麻藥組術后第1天，手術組術后第1、3、5天學習記憶能力受損，與對照組相比，潛伏期延長，錯誤率增加，訓練次數增加，主動逃避率減少(P<0.01或P<0.05)。結論聯合采用復合全麻藥物及手術創傷方法制備的術后認知功能障礙小鼠模型能有效重現術后認知功能障礙患者的發病特點。

關鍵詞:老齡; 麻醉; 手術創傷; 術后認知功能障礙; 模型

NMDA受體拮抗劑、GABA受體激動劑單用都可導致神經元毒性。大量文獻顯示麻醉和手術會加重隨著年齡增長的中樞神經系統的退行性改變，老齡、麻醉藥物、手術與POCD的發生有著重要聯系。本研究模擬臨床復合老齡、麻醉藥物、手術創傷多種致病因素，建立了術后認知功能障礙動物模型，旨在重現術后認知功能障礙患者的發病特點，分析麻醉藥物、手術創傷對小鼠神經行為學影響，并將其應用于術后認知功能障礙發病機制及其藥物預防方面。

1材料與方法

1.1　材料

36只健康老齡BALB/c小鼠(月齡20～22 m, 體質量60～70 g, SPF級)，由河南省實驗動物中心提供。動物生產許可證號為SCXK(豫)2010-0002，使用許可證號為SYXK(豫)2011-0010。IVC飼養環境下溫度都維持在23 ℃, 12 h交替黑白周期,供應充足的水和食物，不健康的小鼠排除。

1.2　藥品和儀器

藥品：異氟醚(Nicholas Piramal公司，批號A01A11A)，氯胺酮(福建古田藥業有限公司，批號130223); 儀器：Y型迷宮測試儀(上海軟隆科技發展有限公司)

1.3　方法

經7～10 d適應環境后，將動物隨機分為3組。空白對照組(n=12)不給予麻醉藥物和實施手術；麻醉藥物組(n=12)實驗動物接受1.5%～2%異氟醚誘導1～2 min, 然后腹腔注射氯胺酮100 mg/kg, 持續吸入異氟醚60分達到相應手術最大刺激無痛，生命體征維持正常麻醉深度。麻醉藥物手術組(n=12)小鼠給予復合麻醉藥物后實施剖腹探查脾切除手術。具體手術操作步驟：首先切口處備皮、按無菌操作碘伏消毒,在上腹部正中線偏左做3～4 cm切口，進入腹腔后探查肝脾腸管約20 min, 切除脾臟，然后用縫線依次縫合腹膜、皮下組織及皮膚。術后待老鼠麻醉恢復后放回籠子里各自飼養。

Y迷宮實驗:麻醉組、手術組分別于麻醉術后第1、3、5、7天行Y迷宮實驗，記錄各組所需的訓練次數，潛伏期，主動逃避率；Y型迷宮裝置由3個支臂和一個中間連接區組成，在每臂底部鋪以與刺激電源相通細銅棒。信號燈裝在各臂末端，信號燈開啟的區域表示該臂為安全區，該臂底部不通電。實驗開始時，讓小鼠在起步區適應5 min左右，在安全區的信號燈亮起5 s后，開通刺激電源給起步區、非安全區通電，小鼠受電擊后跑至信號燈亮起的安全區后結束一次訓練。依次變換安全區和電擊區的位置，重復以上訓練過程直到小鼠達到學會的標準：連續10次測試中有9次正確，結束實驗。記錄訓練次數，潛伏期，主動逃避率。小鼠的潛伏期即反應時間，是指從安全區信號燈亮開始到大鼠第1次逃至燈亮區為止所消耗的時間；主動逃避率指信號燈亮后起步區、非安全區未通電的5 s內完成逃避反應的次數占總反應次數的百分率。

1.4　統計學分析

所有數據采用SPSS 17.0處理。統計描述以均數±標準差(±s)表示，統計分析采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett T檢驗。對于不符合正態分布或方差齊的數據，做對數轉換后進行統計檢驗。P<0.05認為有統計學意義。

2結果

與對照組相比，麻醉組術后第1天的空間記憶學習能力(P<0.05) 受到破壞，潛伏期延長，訓練次數增加，主動逃避率減少，錯誤率增加，在術后第3天恢復(P>0.05) 。手術組小鼠在術后第1、3和5天尋找安全區潛伏期時間明顯長于對照組小鼠(P<0.01或P<0.05)，主動逃避率減少(P<0.01或P<0.05), 總訓練次數與對照組比較明顯增加(P<0.01或P<0.05)，持續到術后第7天各項與對照組無明顯差異(P>0.05)。見表1、2、3。

表1　Y迷宮實驗中各組小鼠達標訓練次數

與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

表2　Y迷宮實驗中各組小鼠潛伏期

與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

表3　Y迷宮實驗中各組小鼠主動逃避率

與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

3討論

本研究手術創傷模型建立選取了剖腹探查脾切除術，研究結果證實手術創傷會導致實驗鼠術后空間分辨學習能力、防御保護反射遭到破壞。與單純麻藥組相比，復合手術創傷更容易引起老年鼠術后認知功能障礙且持續的時間更長。海馬參與中樞神經系統內信息系統功能的整合，是與學習記憶等大腦最高級的認知功能密切相關的重要部位。任何損毀海馬造成損傷的因素均可能導致認知學習記憶功能下降。全麻藥物通過調控特定的配基門控離子通道，主要是γ-氨基丁酸型A受體和N-甲基D-天門冬氨酸受體亞型-谷氨酸受體，從而改變突觸的功能，改變神經突觸可塑性[1]。全麻藥物作用于大腦引起中樞神經遞質生成、釋放、儲存和滅活過程異常和受體系統敏感度發生改變，這些均可導致術后學習、記憶力等認知功能的變化[2]。Culley等[3]研究顯示,大鼠吸入異氟醚后，對老年大鼠的空間分辨記憶損害作用可持續數周。異氟烷通過激活內質網膜1，4，5三羥甲基氨基甲烷磷酸鹽受體引起鈣離子過度釋放及減少組織型纖溶酶原激活物釋放而啟動內源性凋亡途徑[4]。在體外和體內實驗研究[5]已證明異氟烷的細胞毒性作用是引起認知功能障礙的危險因素。氯胺酮可與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結合產生非競爭性抑制作用，抑制海馬CA1 區對各種刺激作用后的長時程增強(LTP)效應，從而干擾學習記憶過程, 同時氯胺酮還可與nAch受體結合，促使NMDA受體通道亞單位NR2B mRNA 的表達下調， NMDA 受體的結構發生改變從而損害認知功能[6]。Morgan等[7]給予志愿者小劑量氯胺酮呈現出劑量依賴性的間斷記憶和工作記憶損害，口服氯胺酮在3 d后出現語義記憶等多種記憶功能的損害，注意力不集中和精神分裂樣癥狀。因此本實驗麻醉藥物采用神經損傷報道較多的異氟醚和氯胺酮 。

麻醉組術后第1天的空間記憶學習能力在術后第1天受到破壞，潛伏期延長，訓練次數增加，主動逃避率減少，錯誤率增加，術后第3天已恢復至正常提示單純的麻醉因素并不能引起認知功能的長時間破壞，實驗動物單純接受麻醉藥物處理不是一個很好的POCD模型。大量研究[8]報道，是手術因素而非麻醉與精神紊亂、POCD的發生有密切的關系。強烈持續應激影響下丘腦垂體-腎上腺皮質軸功能改變，引起循環中糖皮質激素濃度增高，中樞Ach、NE和5-HT等遞質產生釋放發生紊亂，影響海馬突觸間聯系導致記憶和學習能力下降。脾切除手術組的設立是為了給動物造成一定程度的創傷形成，有研究[9]認為手術侵襲程度的大小對老年人術后認知功能損害的影響不同，創傷程度大的手術后，患者術后更容易出現學習機記憶功能障礙。臨床上術后認知功能障礙(POCD)多見于出血量多、手術時間長、創傷應激反應強烈的病人。手術創傷激活外周免疫系統釋放各種炎性因子，C反應蛋白、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)、膠質細胞等在血液中和大腦組織中高表達。中樞小膠質細胞被激活后，釋放類花生酸類物質、炎性因子、補體、過氧化物、興奮性氨基酸和NO等可溶的炎性分子。Wan[10]研究顯示脾切除手術后引起空間辨別、學習認知能力的下降與膠質細胞激活及海馬區炎癥介質的釋放有關。Ramlawi等[11]研究發現，冠狀動脈搭橋手術術后POCD發生的患者組C反應蛋白的表達水平顯著升高。因此圍術期手術創傷和應激引起的炎癥反應在認知功能減退中起著重要作用。本實驗手術組小鼠在術后第1、3和5天尋找安全區潛伏期時間明顯長于對照組小鼠，主動逃避率減少，總訓練次數明顯增加持續到術后第7天同樣證明手術創傷與認知功能有密切關系。

Y迷宮實驗是測試動物海馬依賴或非海馬依賴空間學習記憶能力的較為普遍的方法[12]。訓練期所測試的潛伏期代表實驗動物的學習記憶能力，潛伏期越長其學習能力越差；主動逃避率反映受試動物的空間記憶保持能力，受試動物在燈亮后起跑時間越早主動逃避次數越多其記憶能力越強。小鼠能在電刺激尚未開始時根據安全區燈亮主動回避電擊逃往安全區表明小鼠已經形成了明暗辨別條件反射。POCD是一個多因素的綜合征，可能是在腦退行性改變及易感基因的基礎上，在圍術期的持續應激刺激和藥物作用影響下多種因素共同作用導致的結果。手術創傷大、手術應激性高及體外循環心臟手術均是老年患者POCD高發因素。手術本身干擾人體內環境改變啟動免疫級聯反應，本試驗結果同樣提示中樞神經系統退行性改變與POCD的發生可能有著重要聯系，而麻醉和手術會加重隨著年齡增長中樞神經系統

經歷的退行性改變，老齡、麻醉藥物、手術與P0CD的發生有著重要聯系。聯合采用復合全麻藥物及手術創傷方法制備的術后認知功能障礙小鼠模型能有效重現術后認知功能障礙患者的發病特點, 可將其進一步應用于發病機制及其藥物預防方面的研究。

參考文獻

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論著

Establishment of POCD animal model and neurobehavioral study

QIAN Xiaolan1,2, WANG Qingduan3, ZHANG Wei4, ZHOU Yubing4,

ZHANG Jingmin2, JIANG Jinhua3

(1.DepartmentofAnesthesiology,TheThirdPeopleHospitalofHenanProvince,

Zhengzhou,Henan, 450006; 2SchoolofMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,

Henan, 450001; 3.InstituteofMedicalScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,

Henan, 450052; 4.DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospital

ofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan, 450052)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish a POCD model and to analyze the effects of anesthetic drugs and surgical trauma on the neurobehaviors. MethodsHealthy aging BALB/c mice were randomly divided into three groups: control group, anesthetic drugs group and surgery group. On the 1st, 3rd, 5th and 7th days after surgery, neurobehavioral changes were observed by Y maze test. Training times, latency time and active escape rate reached the standard for mice in the lost discrimination learning were recorded. ResultsThe impaired learning and memory appeared on 1st day in anesthetic drugs group and on 1st, 3rd and 5th day after surgery in surgery group, in which latency time was prolonged, the error rates increased, the training times increased and active escape rate reduced when compared with control group (P<0.01 orP<0.05). ConclusionThe POCD mice model is established through compound general anesthesia combined with surgical trauma, and this model can effectively reproduce POCD characteristics.

KEYWORDS:senile; anesthesiology; surgery trauma; postoperative cognitive dysfunction; model

基金項目:河南省醫學科技攻關計劃項目(201304073)

收稿日期:2015-04-25

中圖分類號:R 332

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)21-001-03DOI: 10.7619/jcmp.201521001