基于納微米顆粒和凝膠佐劑的新型疫苗傳遞體系

岳　華,馬光輝

(中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

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特約專欄

第一作者：岳華，女，1984年生，助理研究員

Email:ghma@.ipe.ac.cn

基于納微米顆粒和凝膠佐劑的新型疫苗傳遞體系

岳華,馬光輝

(中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

摘要：新型疫苗的飛速發展對佐劑或遞送體系的研究提出了巨大的挑戰。針對傳統佐劑在細胞免疫應答方面不足的問題，選取生物相容性好的高分子材料為主要基質，設計并制備出一系列尺寸均一且具有不同顆粒性質(粒徑、電荷或表面基團)的納微米顆粒佐劑。研究表明，新型顆粒佐劑表現出良好的增加抗原內化、促進抗原提呈和T淋巴細胞增殖等優勢，有望滿足重要傳染性疾病甚至惡性腫瘤的防治需求。此外，針對目前仍無有效黏膜免疫佐劑的難題，以具有生物粘附性的殼聚糖為基質，開發了溫度敏感性凝膠作為疫苗佐劑。該凝膠佐劑不僅可以使鼻黏膜制劑有效鋪展和停留，還可以借助材料本身特性增加抗原滲透性并活化T細胞，從而誘導高效的免疫應答，拓展了傳統以注射為主的免疫遞送方式。上述基于納微米顆粒和凝膠佐劑的疫苗傳遞體系的系統性研究，為新型疫苗傳遞系統的開發提供了有意義的探索。

關鍵詞：納微米顆粒；凝膠；佐劑；疫苗傳遞系統；微孔膜乳化法

1前言

疫苗領域重要的難題之一是選擇合適的佐劑和遞送體系。傳統疫苗經常直接來源于細菌或病毒，即使不添加佐劑也具有較高的免疫原性，但由于大量病原性組分的存在會導致安全性問題，此類疫苗正逐漸被替代。隨著生物技術的發展，成分明確、安全穩定的新型亞單位疫苗開始出現，但其免疫原性較差，難以誘導良好的免疫應答效果，必須添加佐劑才能發揮疫苗抗感染的特性[1-2]。鋁佐劑是應用最為廣泛的佐劑，不過其局限性在于僅誘導體液免疫應答，無法產生細胞免疫應答，目前多用于特定傳染性疾病的預防方面，對亞單位疫苗(如H5N1裂解疫苗)效果不明顯，并且無法滿足其它新型疫苗尤其是治療性疫苗的發展需求。后續開發的油乳佐劑、弗氏佐劑、脂多糖等在免疫效果方面有所提升，但多數制劑在注射后會引起注射部位結塊，甚至系統性過敏性休克等反應，導致疫苗產品無法被FDA批準(繼鋁佐劑70余年后才有一種MF59佐劑獲批)。此外，很多感染性病原(包括禽流感病毒及手足口病EV71病毒等在內)都是通過呼吸道黏膜表面侵入機體的，僅依靠傳統的疫苗注射方式遞送抗原，在提高機體保護力方面十分有限。新型的黏膜遞送系統將很大程度上改善這一缺陷，遺憾的是現有的佐劑起初均針對注射式抗原而開發，忽略了黏膜特殊的生理結構和功能，無法有效地刺激黏膜抗體的產生。因此，疫苗的開發受到了嚴重限制，而研制高效而安全的新型佐劑或遞送體系，從某種程度上將決定新型疫苗的誕生。

本研究小組長期以來一直致力于生物材料及生物劑型工程等領域的發展，并圍繞顆粒和凝膠佐劑的研究和應用開展了一系列工作。與傳統的佐劑相比，納微米顆粒(如膠束、聚合物顆粒、脂質體等)由于同自然界中的病原性細菌、真菌等尺寸或維度相近，容易被機體識別為外源性物質，激活機體的免疫應答[3]。納微米顆粒的優勢使其有望成為高效、安全的疫苗佐劑，但如何使之發揮所期待的效果是當前研究的重要難題。基于納微米顆粒對生物學效應影響的理論研究基礎，通過調控顆粒的物理或化學性質，開發出具有優良理化性質的顆粒佐劑，可滿足疫苗對機體特異性應答的需求。針對黏膜免疫的應答特點，開發出溫度敏感性水凝膠佐劑，通過調整組分性質制備出具有合適相轉變時間和溫度的凝膠制劑，可滿足呼吸道傳播疾病的預防性疫苗需求。對上述新型顆粒佐劑和凝膠佐劑的系統性研究，不僅為借助疫苗對抗病原體的早期感染甚至發揮更深層次的治療殺傷效果提供了借鑒，也為新型疫苗傳遞系統的免疫應答機理進行了有力補充。

2新型顆粒佐劑疫苗的研究進展

2.1尺寸均一乳液和顆粒佐劑的制備

在諸多的納微米顆粒中，聚合物顆粒基于其獨特的優勢成為近年來的研究熱點。制備聚合物顆粒的材料按其來源可以分為天然和合成高分子材料兩大類。天然高分子材料如淀粉、殼聚糖、海藻酸鹽、明膠以及白蛋白等具有良好的生物相容性，幾乎都可降解而且降解產物無毒。其中殼聚糖、海藻酸鹽因材料廉價、易得并具有較好的生物安全性，在生物醫藥領域受到廣泛關注。常見的合成高分子如聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸(PELA)、聚酸酐和聚己內酯等具有結構和性能可人為調控等優點，近幾十年來發展迅速。PLA和PLGA是最典型的合成高分子材料，具有很好的生物降解性和生物相容性，已被FDA批準作為可生物降解材料用于藥物輔料。

傳統高分子聚合物顆粒制備方法如超聲、攪拌、均質等，由于剪切場不均一和Oswald熟化現象，無法形成均一液滴，造成乳液的穩定性差，體內分布不具有規律性。雖然有少量研究工作嘗試將納微米顆粒作為佐劑，評價其免疫學效果，然而由于評價中所使用的顆粒可能存在粒徑分布寬、個體差異性大的問題，導致結果出現不一致甚至截然相反的現象[4]。為解決上述難題，作者團隊發展了一種獨特的微孔膜乳化技術，通過選取合適的膜孔徑來實現顆粒尺寸的控制(100 nm～100 μm范圍內可控)，在膜孔均一剪切和合適壓力的作用下，制備得到粒徑均一的液滴，固化成球后進而得到粒徑均一的顆粒(圖1)，從而保證了實驗的準確性和可重現性。基于該項核心技術，通過過程控制手段可以獲得具有不同結構和不同性質的納微米顆粒[5-6]，進而滿足疫苗多樣化和抗原釋放的需求，最大程度地發揮佐劑疫苗的免疫應答效果。

圖1　微孔膜乳化法原理示意圖(a)及利用該技術制備的PLA微球(b)和殼聚糖微球(c)Fig.1　Schematic diagram of membrane emulsification process (a) and PLA microparticles (b) and chitosan microparticles (c) prepared by this process

2.2納微米顆粒佐劑的設計及應用舉例

在制備出均一顆粒的前提下，我們對顆粒佐劑引發的免疫應答體系進行了系統的探索，一方面是對免疫知識體系的補充，另一方面也期待能為顆粒佐劑的設計提供思路。例如，借助微孔膜乳化優勢技術，制備出粒徑均一且具有不同粒徑的3種顆粒，從單因素水平分析粒徑效應，保證評價結果的可重現性和準確性。與粒徑較大的微米球(如4.8 μm、1.9 μm)相比，納米球更容易被巨噬細胞(抗原提呈細胞APCs)大量而快速地攝取(圖2，顆粒為灰白色)。納米球被內吞后其顆粒表面積最大，適合作為有效的抗原吸附和運輸載體，而微米球展示出較大的內吞顆粒體積，在包埋抗原方面可能更具有優勢[7]。此外，粒徑影響了細胞因子表達水平，納米球更有助于促進細胞免疫相關因子(如IL-12等)的分泌。

圖2　J774A.1細胞對不同粒徑大小的納微球攝取的顯微照片 :(a) 430 nm, (b) 1.9 μm和(c) 4.8 μmFig.2　Micrographs of different sized micro/nanoparticles absorbed by macrophages :(a) 430 nm,(b) 1.9 μm,and (c) 4.8 μm

除粒徑之外，我們還研究了顆粒其他理化性質對生物學效應的影響[8-10]。以親疏水性為例，選取主體結構為聚乳酸的3種材料(PLA、PLGA、PELA)，并借助膜乳化技術可制備出疏水性不同且粒徑均為1 μm的顆粒(PLGA和PELA因分別含有羥基乙酸和聚乙二醇而親疏水性不同)。通過比較三者在細胞攝取、細胞活化、細胞遷移行為后發現，隨著顆粒表面疏水性的增強，顆粒的佐劑效果也隨之增強。為揭示相關作用機制，通過巧妙地將3種微球修飾于原子力顯微鏡探針上，原位分析了細胞與顆粒間的相互作用，發現顆粒疏水性的增強將增大顆粒與細胞(尤其是疏水細胞膜)的相互作用力，進而推動細胞的攝取行為，最終提升免疫應答。

上述研究提示我們，顆粒的粒徑大小及表面性質等不僅會影響抗原負載行為，還對后續的細胞學、免疫學效應有重要影響。傳統的預防性疫苗，主要激活CD4 T細胞，刺激抗體分泌，中和血液中游離的病毒，引發體液免疫應答。后續發展的治療性疫苗或腫瘤疫苗，通過激活CD8 T(CTL)細胞，釋放穿孔素等，特異性地殺傷和裂解已經被病原體感染的細胞，而引發細胞免疫應答。基于對顆粒性質影響佐劑免疫效果的知識體系，通過設計和調控顆粒性質，有望滿足不同類型疫苗對免疫激活和應答方面的需求。

2.2.1預防性疫苗

單獨H5N1流感裂解疫苗作為新型疫苗具有安全性高、易于大批量生產的優勢，但其免疫原性較弱，需要疫苗佐劑保護疫苗不被降解，同時增強其免疫原性。為解決上述難題，作者團隊將前期構建的一種溫敏性殼聚糖凝膠體系與快速膜乳化技術相結合，利用顆粒37 ℃發生自固化現象，制備出一種新型顆粒作為H5N1流感裂解疫苗佐劑[11]。首先將溶有殼聚糖或其衍生物的弱酸溶液與甘油磷酸鹽水溶液在低溫下(4 ℃)混合，混合后溶液為中性(pH 7.4)，經過快速膜乳化得到油包水型乳液后升溫至37 ℃，乳滴將發生自固化形成顆粒。與傳統的殼聚糖顆粒相比，該溫敏性顆粒制備和固化過程溫和，避免了因使用化學交聯劑導致的抗原失活，提高了生物利用度。研究發現，該顆粒注射制劑能顯著提高H5N1疫苗誘導的體液免疫應答，血清中特異性總IgG抗體效價和血凝中和抗體顯著高于商品化Al佐劑組和LPS組，表現出很好的預防效果。更重要的是，該顆粒還具有pH敏感性，可以促進抗原被樹突細胞(DC)攝取并從溶酶體逃逸到細胞質，顯著提高H5N1疫苗誘導的細胞免疫反應，在提高體液免疫應答的同時發揮交叉保護能力。

圖3　CS-NH2(伯胺顆粒，左)和CS-CL(叔胺顆粒，右)表面基團示意圖Fig.3　Schematic diagrams of the structure of different chemical groups on the particles surface of CS-NH2(left) and CS-CL(right)

炭疽是由炭疽桿菌所致的一種人畜共患的急性傳染病，作為一種大規模殺傷性武器，至今仍然對人類構成重大威脅。目前的減毒滅活疫苗和鋁佐劑基因重組疫苗雖有效力，具有一定副作用或效力不穩定，亟需新的疫苗佐劑。通過利用殼聚糖和海藻酸鈉，結合快速膜乳化技術和層層自組裝技術，制備出含有不同表面基團的1 μm顆粒(CS-NH2和CS-CL)(圖3)，然后與重組炭疽抗原(rPA)復配可得到疫苗制劑[12]。細胞試驗表明，兩種顆粒對抗原的吸附率一致，并且被APCs的攝取的情況相當(均高于單純抗原組且二者間無顯著差異)。但與表面富含叔胺的CS-CL顆粒相比，富含伯胺的CS-NH2顆粒誘導機體產生了快速的但可恢復的炎癥激發反應(顯示出良好的生物安全性)，并顯著增強了抗原特異性的血清抗PA抗體分泌水平，提高疫苗的免疫保護能力。CS-NH2顆粒之所以表現出上述優勢，主要因其表面富含親核反應性很強的伯胺基團，能與補體系統中的C3b分子共價結合，從而引發補體反應。提高APCs抗原攝取量通常是免疫效果提升的前提條件，該研究通過引入特定的表面基團，在攝取量一致時，通過誘導APCs攝取活化之外的激活途徑同樣也可以獲得高效的免疫應答，為預防性顆粒佐劑開發的開辟了一個新的視角。

2.2.2治療性疫苗

由于外源性抗原通常經溶酶體降解，引起CD4 T細胞為主的體液免疫應答，因此激發機體產生高效的細胞免疫應答是治療性疫苗最大的挑戰。雖然鋁佐劑能夠誘導高效的體液免疫反應，但由于其本身固有的局限性，對細胞免疫應答無能為力。如果借助新型佐劑改善抗原的提呈或降解途徑，將有可能激活CD8 T，殺傷感染細胞，輔助疫苗發揮治療效果。

前期與微米顆粒的比較表明，納米顆粒有利于促進APCs分泌與細胞免疫應答相關的細胞因子。借助納米球佐劑的理論成果，嘗試將PLA納米球(350 nm)與HBsAg復配制得疫苗制劑，對納米球作為治療性乙肝疫苗佐劑進行了應用探索[13]。與商品化鋁佐劑相比，該納米球顆粒體系不僅可以增加乙肝抗原被細胞的攝取，提高抗原(灰白色)與細胞相互作用的機率，而且能夠拓展抗原的運輸途徑，使其逃脫溶酶體(灰色)游離于胞質中(圖4a)。在APCs攝取和提呈抗原效率同時得到提升的基礎上，納米球佐劑有效上調了細胞免疫應答的兩個關鍵評價指標，直接對靶細胞發揮細胞因子IFN-γ(圖4b)和細胞毒性T細胞CTL(圖4c)的特異性裂解作用。該研究說明，納米顆粒在引起細胞免疫方面具有獨到的優勢，為治療性疫苗打破乙肝病毒導致的免疫耐受提供了理論上的可行性。

圖4　納米顆粒促進抗原從溶酶體逃逸(a)從而提升IFN-γ分水平(b)和CTL殺傷活性(c)Fig.4　Nanoparticles promote the antigen to escape from lysosomes (a) ，induce higher IFN-γ level (b) and CTL lysis activity (c)

為了得到更高水平的細胞免疫效果，分別采用3種多聚陽離子聚合物(殼聚糖CS、殼聚糖鹽酸鹽CSC和聚乙烯亞胺PEI)對PLA顆粒表面進行鍍層修飾[14]。修飾后的微球顆粒表面電勢由負到正翻轉(其中PEI-PLA顆粒荷電水平最高)，并且對HBsAg抗原的吸附量也隨之增加。其中，荷正電最多的PEI-PLA體系可以使抗原最大程度地被APCs細胞內化，提高炎癥相關細胞因子的表達，在體內誘導產生了接近甚至超過鋁佐劑的高水平乙肝IgG特異性抗體。特別地，鍍層后的PLA顆粒更容易促進抗原逃逸出溶酶體，其中PEI-PLA顆粒還能同時提升IgG2a(偏向細胞免疫)比例，顯示出良好的細胞免疫效果。因此，增加顆粒的正電性能夠進一步提高顆粒活化APCs的效果，最終獲得高水平的體液和細胞雙重免疫應答。由此可見，通過調控顆粒性質拓展抗原的運輸途徑，是治療性疫苗發揮細胞免疫應答的有效途徑。

2.2.3腫瘤疫苗

相比于放療、化療等傳統治療腫瘤的方法，免疫治療(如腫瘤疫苗)因其特異性高、副作用低等優勢引起了廣泛關注。然而，腫瘤抗原免疫原性低，難以引起有效的腫瘤殺傷效果。為了增加腫瘤抗原被機體免疫系統識別的機會，作者團隊設計并制備了修飾有細胞穿膜肽(CPP)的尺寸均一的PLGA納米顆粒(CNP)[15]。借助腫瘤細胞對納米顆粒的攝取作用，將兩種細胞因子佐劑(粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF和白細胞介素2 IL-2)高效導入腫瘤細胞內，經滅活后制成多佐劑復合型腫瘤全細胞疫苗(圖5)。修飾CPP后的納米顆粒，不僅可以使免疫因子快速導入腫瘤細胞內，而且避免了溶酶體對外源性物質的降解以保證免疫因子的活性。體內的治療效果研究表明，疫苗中的復合成分，可以針對不同免疫應答環節起效，使大量CTL遷移到腫瘤病灶部位，有效地抑制了腫瘤的生長，延長了小鼠的生存時間。此外，疫苗免疫后的小鼠血清中反映肝、腎和心肌毒性指標值均處于正常范圍內，證明了該疫苗具有良好的安全性。通過在顆粒表面嫁接配體，可以避開靶向至腫瘤細胞，

前面所述的絕大多數顆粒佐劑主要以球型為主，隨著新材料新技術的出現，開發與傳統顆粒形狀甚至維度不同的新型顆粒佐劑也將成為可能。例如，通過對二維平面粒子氧化石墨烯(GO)的生物學效應進行系統性評價，揭示了新型二維粒子與三維球型顆粒截然不同的性質[16]。與微米級GO相比，納米級GO更能夠引起APCs強烈的應激性行為，分泌與免疫激活相關的細胞因子。基于該結果，借助二維GO粒子所特有的疏水多環平面結構和高比表面積性質，采用簡便而快速的吸附策略，制備出具有超高抗原負載量的腫瘤疫苗制劑。初步的動物實驗表明，基于GO的腫瘤疫苗體系，可同時提升APCs細胞募集、抗原加工提呈以及T細胞免疫應答的效果。該研究豐富了以傳統球型顆粒為主的知識體系，并拓展了新型顆粒在疫苗領域應用的多樣化設計范疇。

圖5　基于納米顆粒的多佐劑復合型全細胞腫瘤疫苗示意圖Fig.5　Schematic diagram of nanoparticles-based multi-adjuvant whole cell tumor vaccine for cancer immunotherapy

2.3納微米顆粒佐劑作用機理

2.3.1增加APCs對抗原的攝取和提呈

傳統鋁佐劑以及新型顆粒佐劑的作用機制如圖6所示。單純抗原制劑經肌肉注射后，會被機體快速清除[17]，而鋁鹽佐劑可以顯著提高其在注射部位的停留(儲庫效應)，誘導嚴重的炎癥反應，募集大量的免疫細胞(如中性粒細胞、DC等)[18]。顆粒佐劑因其材料來源和表面性質的不同，作用機制有所區別。如殼聚糖凝膠顆粒在注射后也發揮了類似募集APCs的作用，但PLA微球佐劑卻并未延長抗原在注射部位的停留，而是略微加速了抗原被APCs的清除。然而，兩種顆粒佐劑共同的特點是可以促使大量抗原進入APCs，其中表面帶正電荷的顆粒更有利于被細胞內化攝取，促進細胞分泌與免疫激活相關的細胞因子。

圖6　鋁佐劑和納微米顆粒佐劑的不同作用機制圖示Fig.6　Graphic representing of mechanisms of alum and MP/NPs adjuvanted vaccine.

2.3.2提升抗體滴度水平

鋁鹽佐劑可以促使外源性疫苗抗原以MHC II的途徑提呈到APCs表面，從而為CD4 T細胞提供特異性的抗原識別信號。這也是鋁佐劑可以誘導IgG抗體水平，發揮高效體液免疫應答的原因之一。與鋁佐劑相比，顆粒佐劑也可以提升APCs(如脾細胞DC)的MHCⅡ分子的表達量，誘導產生接近甚至超越鋁佐劑的IgG滴度水平，以及更高水平的中和抗體(HI)滴度和IgM滴度(免疫應答初期)。由此可見，在以預防為主的體液免疫方面，顆粒佐劑具有匹配或略微強于鋁鹽的佐劑效果。

2.3.3提高細胞免疫應答

商品化鋁佐劑無法有效提升細胞免疫應答的可能原因是T細胞識別信號MHC I和CD80/CD86共刺激因子表達水平的下調[13]。與之相反，顆粒佐劑可以同時提升APCs的MHC I分子和共刺激因子的表達水平，從而為特異性CD8 T細胞提供識別(第1信號)和激活(第2信號)。特別地，外源性抗原從溶酶體逃逸至胞質中降解，循MHC I分子途徑提呈(即“交叉提呈”)激活CD8+CTL，是以顆粒為佐劑的治療性疫苗或腫瘤疫苗發揮作用的關鍵。激活后的CTL通過釋放穿孔素和顆粒酶裂解靶細胞，達到殺傷清除靶細胞的目的。因此，在以治療為主的細胞免疫應答方面，顆粒佐劑發揮著獨特的優勢，遠優于當前商品化佐劑的效果。

3新型凝膠佐劑疫苗的研究進展

3.1凝膠佐劑的制備

目前仍沒有針對黏膜系統的免疫佐劑，多數是將傳統的佐劑體系制成溶液、噴霧或粉末等，其黏膜粘附性差，容易被清除，無法有效攜帶抗原跨越黏膜系統屏障。而高分子水凝膠，具有良好的粘附性，有助于延長抗原與黏膜的接觸時間，可作為黏膜免疫抗原的良好遞送載體，彌補目前黏膜免疫佐劑的不足。天然多糖殼聚糖是近年來被廣泛關注的高分子凝膠材料，通過將殼聚糖改性合成得到殼聚糖季銨鹽材料，一方面可以改善殼聚糖的水溶性，另一方面增加其正電荷量以增強黏膜粘附性[19]。研究發現，季銨鹽殼聚糖(HTCC)與甘油磷酸鈉(GP)通過電荷相互作用后能夠形成一種具有明顯的溶液(Sol)-凝膠(Gel)轉換特性溫度敏感的水凝膠(圖7)。在此過程中，HTCC含量、GP含量以及季銨取代度(QD)都會影響凝膠體系的黏度和凝膠轉變時間。以QD為例，取代度越高(>79.5%)時，在37 ℃下加熱后，體系需要較長時間發生從溶液到凝膠的轉變。一方面是因為季銨基團引入越多，空間位阻作用越大，分子鏈不容易卷曲而聚集；另一方面，季銨基團的陽離子性較強，增大了鏈間的靜電斥力，阻礙了分子鏈的相互靠近；同時，季銨基團具有較強的親水性，在周圍形成一層規整的水合層，增加了溶液穩定性。

圖7　季銨鹽殼聚糖溫敏性水凝膠機理圖(a)及溶液-凝膠狀態照片(b)Fig.7　The mechanism of thermo-sensitive HTCC gel (a) and sol-gel image (b)

通過一系列條件優化，可篩選出適宜鼻黏膜免疫水凝膠載體的配方，使凝膠體系在室溫下為流動性良好的液體，而37 ℃時，能在一定時間內轉變為不流動的凝膠。借助上述特性，凝膠系統與抗原混合后以液體方式滴鼻免疫，可以使抗原在鼻腔能充分鋪展，并與鼻黏膜緊密接觸。在鼻腔溫度下一定時間后，轉變為難以流動的凝膠，從而為后續免疫應答的發揮奠定基礎。

3.2凝膠作為疫苗佐劑的應用探索

流感病毒變異快，人體接種或感染后經常對變異后新病毒不具有免疫力。而黏膜免疫應答誘導產生的分泌性IgA (sIgA) 抗體能產生針對不同亞型病毒的免疫，起到交叉保護作用，在應對流感病毒的感染上具有獨特的優勢。針對流感病毒感染的特殊性，以所開發的殼聚糖水凝膠作為佐劑[20-21]，采用MF59商業化佐劑作為陽性對照，肌肉注射組作為傳統免疫方式對照進行了動物實驗評價。與鼻黏膜免疫其他各組比較，溫敏水凝膠組誘導產生了最高的IgG抗體水平和HI效價，表明凝膠疫苗在機體發生流感病毒感染時，能快速中和病毒表面，減弱其與細胞膜結合而感染細胞的能力。更重要的是，溫敏凝膠組誘導產生了最高的黏膜IgA抗體效價(顯著高于MF59)。雖然抗原肌肉注射組產生的抗體和HI效價較高，但是幾乎未能誘導產生鼻腔和肺部的IgA抗體反應。該結果揭示了凝膠佐劑誘導系統和黏膜共同免疫應答的優勢，同時也反映出針對特定抗原選擇合適疫苗傳遞系統的重要性。

埃博拉病毒也是一種能經過呼吸道傳播的烈性病原體，感染后具有高達90%的死亡率。以HTCC水凝膠作為黏膜免疫佐劑，與埃博拉膜蛋白抗原(Ad-Gpz)混合均勻制得疫苗制劑。小鼠滴鼻免疫試驗表明，凝膠抗原體系在1 h內能維持鼻腔高濃度的抗原量(>80%)，而單獨抗原滴鼻則僅有25%抗原在鼻腔停留。特定HTCC取代度的水凝膠誘導產生高水平的血清IgG和鼻黏膜IgA抗體水平。特別地，凝膠組腸系膜淋巴細胞分泌的抗原特異性的IL-4水平顯著增強，表明鼻腔免疫引起了遠端腸道黏膜的體液免疫反應，這對從腸道黏膜和鼻黏膜兩個方面共同防止病原體的感染具有顯著的優勢。

3.3凝膠佐劑作用機理

3.3.1延長抗原停留時間

鼻黏膜纖毛清除鼻腔異物的半衰期是15 min 左右，因此經鼻的抗原或藥物要達到高的生物利用度需要克服這一生理因素，否則抗原或藥物在鼻腔內還未進入到鼻黏膜下層即被清除體外或進入胃內被強酸環境代謝降解。例如，以MF59為佐劑的疫苗制劑在滴鼻后段時間內即被小鼠吞咽進胃部代謝失活，不能持續刺激黏膜的免疫細胞，只能誘導產生較低的黏膜IgA抗體水平。而水凝膠佐劑可以顯著延長抗原在鼻腔的組織的停留時間。黏膜上皮細胞膜帶負電荷，帶大量正電荷的殼聚糖凝膠溶液可充分鋪展在黏膜表面并借助其電荷相互作用緊密地黏附在鼻黏膜表面。另外，凝膠具有溫度敏感性的特點，在體系從溶液向凝膠轉變后，可有效限制鼻黏膜纖毛的擺動，極大地減緩黏膜的清除速率。

3.3.2增加抗原在黏膜的滲透

單獨抗原僅在1 h內有少量停留。水凝膠和抗原體系在鼻腔發生膠凝后，抗原從水凝膠的網狀結構內逐步擴散到鼻黏膜表面，1 h后抗原進一步滲透至鼻黏膜下層開始彌散均勻的分布，滲透深度為50 μm后到達鼻中隔軟骨組織層，顯示出了凝膠一定的抗原緩釋效果。這種增強作用與凝膠獨特的溫敏性和正電荷性是分不開的。借助殼聚糖季銨鹽強的正電荷效應，有助于刺激細胞之間的緊密連接蛋白ZO-1的聚集和重排，打開黏膜上皮細胞間通路，增強抗原的滲透量(圖8)。而抗原以磷酸鹽(PBS)溶液形式免疫后，主要經鼻黏膜M細胞轉運進入黏膜下層，其通過胞內途徑轉運抗原的效率明顯低于水凝膠細胞間隙途徑。

圖8　水凝膠使得抗原通過細胞間隙進入黏膜下層的顯微照片Fig.8　 Micrographs of hydrogel leading to antigen penetrating to down layer of mucous membrane through cellular gap

3.3.3T細胞的活化

水凝膠協助大量抗原進入到黏膜下層后，可有效地激活鼻黏膜相關淋巴結中T細胞(提升T細胞活化標志CD127)，并加快CD8 T細胞功能成熟并向其他淋巴結和淋巴器官引流。注射免疫不僅不能產生鼻黏膜IgA的抗體反應，對黏膜部位T細胞的抗原特異性激活也處于失效狀態。另外，MF59佐劑并未誘導CD8 T細胞高表達CD127，這可能是因為MF59抗原復合物在鼻腔與黏膜層細胞接觸時間短，對黏膜相關免疫細胞刺激較弱造成。

4結語

隨著生物材料技術的發展，集靶向遞送和聯合刺激于一體的智能型體系將成為新型疫苗傳遞系統的發展方向。首先，基于對佐劑性質對免疫學效果的理論結果，可以在尺寸均一顆粒的基礎上通過對材料的控制、共價偶聯改性或者嫁接靶向配體，進一步引入多個組份，使體系具有特定的功能(運輸或靶向)和活性(免疫刺激或調節)。其次，如何獲得高效而安全的“最優組合”，使引入的各組分不只是簡單相加，而是充分發揮協同作用達到“1+1>2”的提高效果，亟需對免疫學機理進行更深入的探討。對疫苗制劑免疫學效應的考察，可以從細胞層面上的研究向更宏觀和微觀的層面上拓展，從分子-細胞-組織-動物-臨床整體跨層次多尺度地動態研究各組分之間的相互制約和協同作用，將為疫苗遞送體系的設計提供更準確而全面的理論依據和指導。最后，絕對安全的佐劑是不存在的，但可以根據其作用機制盡可能保持微妙的平衡。如通過選擇黏膜、口服或者微針等其它遞送方式，利用佐劑對抗原的特異性靶向(如甘露糖受體)到達APCs細胞，或者通過局部淋巴結達到組織特異性，將有利于保持上述平衡，以達到最大的免疫刺激作用和最小的毒副作用。

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(編輯易毅剛)

專欄特約編輯顧忠偉

顧忠偉:男，1949年生，教授，博士生導師。國家“973”計劃生物材料領域連續三屆首席科學家，國際生物材料科學與工程Fellow，四川省學術與技術帶頭人。1981年畢業于北京大學化學系高分子專業，師從我國高分子學科創始人馮新德院士，1994年被評聘為教授。曾在美國北卡州RTI研究所、猶他大學生物工程系學習工作,2005年被引進四川大學。現任國家生物醫學材料工程技術研究中心主任、四川大學生物材料工程研究中心主任；中國生物材料學會副理事長、中國材料研究學會常務理事、中國生物醫學工程學會常務理事、四川省生物醫學工程學會理事長等；聚合物分子工程國家重點實驗室(復旦大學)學委會委員、國家納米藥物工程技術研究中心(華中科技大學)工程技術委員會委員、南開大學生物活性材料教育部重點實驗室學委會副主任、天津市材料復合與功能化重點實驗室學委會副主任、武漢大學生物醫用高分子教育部重點實驗室學

特約撰稿人胡金蓮

委會委員、中科院生態環境高分子材料重點實驗室學委會委員、中科院寧波材料技術與工程研究所高分子與復合材料事業部學術與工程技術指導委員會委員等。長期從事生物醫用高分子、基因/藥物高效傳遞系統、功能納米生物材料與有序組裝等研究，從可控合成、結構調控、新功能與多功能構筑等方面做了一系列開創性工作。在AdvMater,AngewChemIntEd,ACSNano,AdvFunctMater,Biomaterials,JControlRel,Small等國際著名學術期刊上共發表論文～300篇，以及100余篇國際及全國學術會議報告摘要；授權國家發明專利20余項；編寫及翻譯13部專著及章節(含英文專著/章節)；主持和參與生物材料國際及全國學術會議20余次；多次參與討論并撰寫關系我國生物材料發展的規劃和建議。主要研究方向：生物醫用高分子；藥物/基因遞送與控釋系統；納米生物醫用材料；仿生與自組裝生物材料。

特約撰稿人楊　軍

胡金蓮:女，1961年生，香港理工大學紡織及制衣學系教授，博士生導師；智能高分子材料領域活躍和多產的研究者之一，國際著名的形狀記憶高分子材料科技領域的領航者之一，引導了世界形狀記憶紡織品科技研究的潮流。主要從事智能聚合物研究，包括形狀記憶聚合物在紡織品、服裝、生物醫學領域的基礎研究和應用研究；紡織材料的檢測、儀器測試、紡織結構/動力學；纖維復合材料研究以及織物外觀、織物懸垂性的數字化評估和模擬。2003年成立形狀記憶紡織品研究中心，擔任中心主任。2004年全球首創形狀記憶纖維素面料，并且奠定了形狀記憶聚合物在紡織上應用的理論基礎。首次提出了形狀記憶聚合物性能如何與紡織品性能相結合的概念，在生物醫學領域上研發新物料及產品。

楊軍:女，1968年生，工學博士，教授，博士生導師。主要從事生物材料與再生醫學研究。近年來著眼于融合生物學、材料學及生物工程學的原理與技術，開發基因工程生物合成融合蛋白生物材料及其與天然多糖的復合材料；研究三維動態仿生細胞外微環境構建的基本機制與技術；進一步揭示材料與細胞之間的相互作用及生物材料在體內外促進誘導組織再生的基本原理和規律；探索肝臟、血管相關組織工程支架材料及其在再生醫學領域的應用開發。發表SCI收錄論文30余篇，被SCI論文引用500余次，授權國家發明專利2項。

特約撰稿人馬光輝

馬光輝：女，1964年生，研究員，博士生導師。1988年獲得日本群馬大學纖維高分子工學科學士學位，1990年和1993年分別獲東京工業大學高分子工學科碩士和博士學位。1994～2001年任東京農工大學生物系統應用科學研究科的Assistant Professor。2001年回國后入選中科院“百人計劃”，國家杰出青年獲得者(2001 年)，“百千萬人才工程”國家級人選(2003 年)，生化工程國家重點實驗室主任、國家生化工程技術研究中心主任、中國顆粒學會副理事長、中國化工學

會生物化工專業委員會副主任委員、中國生物工程學會理事等，國際期刊JMicroencapsulation，FrontierofChemicalScienceandEngineering編委。主要從事高分子微球和微囊的制備及其在生化工程和醫藥工程的應用研究。發明了均一高分子微球和微囊的制備方法，解決了傳統攪拌分散法尺寸不均一、尺寸難以控制且需要篩分的關鍵難題。通過與GE、輝瑞、聯合利華、華蘭生物等企業合作將專利成果產業化，微球和微囊技術及設備在200多家單位獲推廣；在生物化工分離介質、細胞培養微載體、藥物載體等領域獲得重要應用。主持國家科技重大專項2項，自然科學基金重點項目、“973”、“863”等重要課題多項；在JACS,AdvMater，AdvFunctMater，Biomaterials，Nanomedicine，JControlRelease等期刊發表論文210余篇，他引700余次；撰寫英文專著10部。申請中國發明專利75項，國際專利3項；中國發明專利授權42項、國際專利授權3項(美國2、歐洲1)。獲國家技術發明二等獎(2009年)及省部級科技進步獎10余項。主要研究方向：生化反應及生化分離用新型微球介質的制備和應用；新型納微米顆粒疫苗佐劑的制備和應用；蛋白質/多肽藥物緩控釋制劑以及抗癌藥物載體的制備和應用。

The Development of Micro/Nano Particles and HydrogelBased Vaccine Delivery System

YUE Hua, MA Guanghui

(State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering,

Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

Abstract：The development of novel vaccines posed several challenges for the study of adjuvant. To overcome the incapability of conventional adjuvant on cellular immune response, a series of uniform sized micro/nano-particles (MP/NPs) with different physio-chemical properties (size, charge or surface group) were prepared by using the polymer materials with good biocompatibility. MP/NPs could improve the antigen internalization, antigen presentation and T cell proliferation, which were catering for the preventive or therapeutic effect against the infectious diseases or cancer. To complement the nasal immune adjuvant, a novel thermal-sensitive hydrogel, which can undergo sol-gel transition at body temperature were developed by using the chitosan with good bioadhesion. This hydrogel could significantly prolong the antigen residence time, enhance the antigen penetration, and activate the immune cells, thus inducing strong immune responses and expanding the conventional vaccination by injection. The MP/NPs and hydrogel based adjuvant exhibited a promising era for the novel vaccine delivery system.

Key words：micro/nano particles; hydrogel; adjuvant; vaccine delivery system;membrane emulsification process

中圖分類號：R944

文獻標識碼：A

文章編號：1674-3962(2015)03-0216-08

DOI:10.7502/j.issn.1674-3962.2015.03.04

通訊作者：馬光輝，女，1964年生，研究員，博士生導師，

基金項目：國家科技重大專項(2014ZX09102045)；科技部“973”計劃項目(2013CB531500)；國家自然科學基金資助項目(51302265)

收稿日期：2014-10-29