脂肪酶的制備及其在皮革工業中的應用

周秀軍，周利芳，周建民，隋喜龍（威海天智皮毛制品有限公司，山東文登264400）

脂肪酶的制備及其在皮革工業中的應用

周秀軍，周利芳，周建民，隋喜龍
（威海天智皮毛制品有限公司，山東文登264400）

摘要：來源于微生物的脂肪酶在皮革工業中的應用具有無可比擬的優勢。本文綜述了產酶菌株的篩選（觀察透明圈和變色圈）、選育（馴化、誘變或者基因工程手段）和分離純化技術（膜處理、層析、免疫純化、雙水相萃取、反膠團萃取等）。使用脂肪酶處理的皮革顏色均勻、表皮清潔，產品在防水性和低霧化等方面較優。

關鍵詞：脂肪酶；菌株篩選；菌株誘變選育；分離；純化

1　前言

脂肪酶（Lipase, EC 3.1.1.3），也稱三?；视王；饷福瑥V泛存在于動、植物和微生物體內，是一類水解和合成長鏈脂肪酸甘油酯的生物催化劑，在油脂加工、洗滌、食品加工、醫藥、化妝品、皮革加工、飼料、造紙、有機合成、精細化工以及生物能源等諸多領域有著廣泛應用[1]。

脂肪酶不僅可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸，而且能催化水解反應的逆反應-酯化反應。由于具有應用范圍廣及易于生產等特點，微生物脂肪酶已經成為一類在生物技術方面具有重要應用價值的產品，脂肪酶是繼蛋白酶和糖酶之后的第三大類具有應用價值的酶，應用范圍很廣，每年脂肪酶的交易額有10億美元[2-3]。

2　脂肪酶的來源

表1　主要產脂肪酶的微生物

脂肪酶是科研研究中被關注最早的酶類之一，已經有100多年的歷史[4]。脂肪酶廣泛存在于動物、植物組織中及微生物中，尤其是微生物所產的脂肪酶有很多方面的優勢，例如，能夠不被季節、氣候等環境的因素所影響，有利于連續進行工業化的發酵生產；產酶所需的周期短、發酵獲得的產物比較單一，易純化；微生物脂肪酶具有異構體選擇性、耐有機溶劑、高度位置選擇性、底物專一性和高催化活性等特點[5]。因此，微生物來源的脂肪酶研究有很高的實際應用價值，引起各國科研人員的廣泛關注，在理論研究上的發展迅速，帶動了脂肪酶在工業生產實際開發中的應用[6]。目前脂肪酶的研究已成為酶學研究者關注的重點，使其在食品及醫藥生產、油脂的水解和改性、皮革的脫脂以及化妝品添加劑等各個方面得到了非常廣泛的應用[7]。

表1列舉了一部分國內外已經報道的主要產脂肪酶的微生物種類[8]。

3　脂肪酶生產菌株的篩選及誘變選育

3.1脂肪酶生產菌株的篩選

目前篩選產脂肪酶菌株的方法追求的是快速、準確、簡捷、選擇性強等特點，依據應用對象、微生物的種類和酶特異性的不同，對于能夠生產脂肪酶的微生物菌株的篩選方法也各有特色。篩選脂肪酶菌常用的方法是采用含甘油三酯瓊脂平板。首先采集含油污土壤樣品或其它雜物如油垢、廢油布等，無菌水梯度稀釋樣品，涂平板，培養，觀察平板上菌落周圍透明圈或通過在培養基中添加指示劑如羅丹明B、澳甲酚紫、維多利亞藍等作為篩選標記，觀察變色圈的大小。透明圈和變色圈的有無與大小說明菌株產脂肪酶的能力，即透明圈和變色圈越大，菌株產脂肪酶能力可能越大[9]。

（1）觀察透明圈的方法。將處理好的樣品均勻地涂布在含有甘油三酯的固體平板上，根據菌株的直徑與透明圈直徑的比率，確定菌株產脂肪酶的能力大小。如Cardena等[10]、宋欣等[11]將從土壤中采集到的樣品先進行富集培養，然后吸取一部分富集液均勻涂布在含有橄欖油成分的初篩用的平板上，待菌體長出后觀察平板上菌落周圍透明圈的大小來選定所需要的菌株；王美英[12]、謝舜珍等[13]則是選用油同化的平板，即利用油脂作為碳源并且是唯一的碳源進行同化試驗，均篩選出了活性比較高的產脂肪酶的菌株。

（2）觀察變色圈的方法。在固體培養基中加入指示劑作為篩選標記，觀察菌落周圍變色圈的大小，其變色圈越大，說明此菌株生產脂肪酶的能力越大。常用的指示劑主要有三種，分別是溴甲酚紫，羅丹明B和維多利亞藍。例如Yeoh等[14]利用可生色的底物篩選得到了對不同碳鏈長度脂肪酸具有特異性的產脂肪酶的菌株；馬抒晗等[15]以橄欖油為唯一碳源、羅丹明B為指示劑的培養基進行初篩，搖瓶發酵復篩，從70份含油脂豐富的樣品中篩選出

產脂肪酶酶活較高的菌株；施巧琴[16]、張嬋等[17]利用脂肪酸能夠與維多利亞藍反應，從而呈現出藍綠色透明圈的原理，篩選出能夠產脂肪酶的菌株；李春華[18]的初篩過程則是以維多利亞藍B作為指示劑，復篩過程是以羅丹明B作為指示劑，最終也篩選獲得了能夠產脂肪酶的菌株。

3.2脂肪酶高產菌株的選育

從自然環境中經過簡單篩選而分離得到的產酶菌株雖然具備了一定的產酶能力，但是要達到某種特定代謝產物的大量積累，實現優質、高質量和低消耗的高效轉化，則需要對菌株進行選育或改良，以提高脂肪酶產量或者解除、突破微生物自身的代謝調控。提高菌株脂肪酶產量的途徑，主要有菌種改良和發酵工藝優化兩種途徑[19]（發酵工藝優化不在本文討論范圍內）。菌種改良的途徑主要有菌種馴化、誘變育種和基因工程改造等。

3.2.1菌種馴化

通過定向誘導以及貧瘠培養馴化可使產酶菌株對簡單底物的利用能力加強，在一定程度可以提高菌株的產酶活力。與發酵工藝優化有異曲同工之處，同時它也是退化菌種復壯的常用手段之一。

3.2.2誘變育種

誘變育種是微生物改良的常用方法，就是利用物理、化學等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在大大提高其突變頻率的基礎上，采用適當的篩選方法獲得所需要的突變菌株，以供科學實驗和生產實踐使用[20-21]。

誘變劑的種類很多，主要使用的有物理誘變劑和化學誘變劑。目前，以紫外線、亞硝基胍、亞硝酸、硫酸二乙酯、快中子等理化因子作為誘變劑，利用低溫、溴化乙錠、膽鹽、制霉菌素、克霉唑、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、丁酸、己酸、三丁酸甘油酯等作為正突變篩選劑的誘變策略，已成功應用于擴展黑曲霉、青霉、假單胞菌、酵母等多種產脂肪酶菌株的誘變篩選。采用上述誘變和篩選方法,一般可以將脂肪酶產量提高1～10倍，最高可達40倍[22-23]。

3.2.3構建脂肪酶基因工程菌

利用基因工程改造菌株主要有隨機突變與定點突變兩種方式。隨機突變即通過誘導不同突變產生大量突變菌株，再根據不同目的利用有效的篩選方法得到產酶量大幅提高的突變株。定點突變是篩選具有某一相關特性的變異株，再從其中篩選或誘導出高產菌株，從而可大大提高篩選品質和效率，且一定程度上克服了誘變育種的盲目性。目前，利用分子生物學手段篩選脂肪酶高產菌株己受到研究人員的重視[24]。通常情況下利用常規育種方法難以滿足工業化生產的需要，通過基因工程手段克隆脂肪酶基因，并研究其基因表達調控，可以大幅提高脂肪酶的產量。大腸桿菌表達系統、酵母表達系統和曲霉表達系統是目前應用最為廣泛的三種異源表達系統，許多脂肪酶基因均在這些表達系統中實現了大量表達[25]。此外，通過改造脂肪酶基因及分泌蛋白基因以提高脂肪酶產量、活性和穩定性也有許多成功的報道[26]。微生物脂肪酶的高效生產僅僅靠脂肪酶基因的高效表達還是不夠的，還需要酶蛋白質的有效折疊和分泌，基因工程技術和新生產技術的聯合使用改善了工業用酶的性能，提高了產品質量，降低了生產成本，同時也減少了對環境的影響。

4　脂肪酶的分離與純化

酶的分離純化是指將酶從細胞，或者其他酶原料中提取出來，并且與雜質分開，從而獲得符合目的要求的酶制品的過程。主要包括細胞的破碎，目標酶的提取，提取物的離心分離、過濾與膜分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，濃縮，干燥，結晶等[27]。

大部分微生物脂肪酶均為胞外酶，發酵后通過離心或抽濾除去菌體，得到的含酶上清液通過硫酸銨沉淀或有機溶劑萃取濃縮，除去部分雜蛋白質和糖類，然后再用層析法進一步純化。除了少部分基因工程菌能夠高效表達功能性脂肪酶，絕大部分野生型菌株都要聯合兩種以上的層析方法純化才能獲得預期純度的蛋白質[20，28]。目前，脂肪酶的分離純化技術主要包括膜處理技術、層析技術、免疫純化

技術、雙水相萃取、反膠團萃取技術及納米機破碎法等。

4.1膜處理技術

膜的錯流過濾可以從培養基中分離失去生物活性的細胞，應用于脂肪酶的純化，能夠濃縮含有脂肪酶的上清液。目前，具有毛細作用的超濾膜主要研究聚丙烯腈（PAN）和聚砜（PS）兩種，以往的研究發現，透過這兩種膜的脂肪酶流量明顯減少，這種影響在親水的PAN膜上尤為明顯，可純化15倍；而在PS膜上卻并不十分顯著，僅可純化3倍；因此，PS膜更適宜用于濃縮酶，而PAN膜則常用于分餾酶。在PAN膜上，15%的蛋白質可以被吸收，這些蛋白質具有30%的活性；而在PS膜有30%的蛋白質能夠被吸收，這些蛋白質具有40%的活性。經過超濾膜處理的蛋白質損失為15%～30%，酶活損失為30%～40%[29]。

4.2層析技術

傳統分離方法的層析技術包括離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析。脂肪酶產生菌株中只有少數基因工程菌能夠將功能性脂肪酶高效表達，大部分微生物脂肪酶產生的菌株是野生型菌株，產生的酶成分復雜，單一純化方法很難得到較高純度的酶蛋白。由此看來，兩種或多種層析方法聯合進行，并進行多步純化是必要的。

4.3免疫純化技術

免疫純化是一種極具親核力和高選擇性的高效純化方法，這種方法經一步反應將酶純化1 000 ～ 10 000倍[30]。高效的抗體可以分離性質十分相似的抗原，而且克服了許多其他方法無法解決的難題。但是免疫純化法費用昂貴。

4.4雙水相萃取技術

雙水相（Aqueous Two phase System，ATPS）是指不同種類聚合物溶液混合或者聚合物水溶液和鹽溶液混合且當聚合物和鹽濃度達到一定值，混合液靜置后分層產生兩液相或多液相系統[31]。

4.5反膠團萃取技術

近年來，在非水相提取方面發展的一項新技術為反膠團提取生化物質。AOT(二(2-乙基己烷)丁二酸磺酸鈉)/異辛烷反膠團從發酵液中萃取脂肪酶[30，32-34]。

5　脂肪酶在皮革脫脂中的應用

脂肪酶最早的應用是利用它來分解油脂以釋出短鏈脂肪酸，以增加或改進食品的風味，促進干酯熟化，也可以生產代可可脂；利用脂肪酶可催化水解脂類生產脂肪酸和甘油，也可催化酯化反應獲得一些特殊的脂類物質；隨著非水相酶學的深入研究大大拓展了脂肪酶的應用領域，利用其在有機相中所催化的反應已合成許多高價值產品[35-36]。

脫脂是處理動物生皮中一個基本的步驟。脂肪酶可以去除皮中的油脂。酸性和堿性的脂肪酶都可以用來脫脂。脂肪酶水解甘油三磷酸(甘油三磷酸是動物皮中的主要儲存物)為甘油和游離的脂肪酸。加入堿穩定的蛋白酶可以更加有效地去除細胞膜和皮脂腺上的脂肪化合物。脫灰和軟化也可使用脂肪酶。經過鹽漬的皮革可以用酸性脂肪酶來處理[37]。使用脂肪酶的優點在于可以使皮革顏色均勻、表皮清潔。

堿性脂肪酶用于浸水和浸灰時，與蛋白酶聯合使用效果更好。使用脂肪酶脫脂在大多數情況下沒有必要再使用表面活化劑，這有助于產品的防水性和低霧化。酸性脂肪酶可以用于鹽漬的原皮或藍濕皮處理。在制革工業中，傳統的動物皮處理使用石灰和硫化鈉的混合物來脫毛，這種方法操作麻煩并且容易產生污染。皮上的殘余脂肪和蛋白通過化學過程如浸灰等來去除效果不好[38]。為此，使用脂肪酶和蛋白酶混合軟化己經成為慣例[39]。酶可以松散并且去除皮革上的毛，然后通過過濾除去。這樣最終產品要比傳統方法生產的皮革質量高很多。

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基金資助：國家星火計劃（2013GA740002）

Progress in Preparation of Lipase and its Application in Leather Industry

ZHOU Xiu-jun, ZHOU Li-fang, ZHOU Jian-min, SUI Xi-long
(Weihai Tianzhi Fur Products Co., Ltd. Wendeng 264400 ,China)

Abstract:Application of lipase prepared from microorganisms in leather industry exhibits outstanding advantages. This review introduces the strain selection methods such as observation for transparent circle and colouring circle, breed methods including domestication, mutation and genetic engineering, and separation and purification techniques, e.g. membrane treatment, chromatography, immune purification, aqueous two-phase extraction, and reverse micelle extraction technologies. The obtained leather with lipase treatment possesses more uniform color, cleaner grain, better waterproof property and lower fogging value.

Key words:lipase; strain selection; mutation breeding of strain; separation purification

作者簡介：第一周秀軍（1970 -），男，山東文登人，本科，主要從事毛皮動物養殖和毛皮加工工作，E-mail：zhouxiujun888@sina.com。

收稿日期：2015-09-27

中圖分類號：TS 529.1

文獻標識碼：A

文章編號：1671-1602（2015）20-0016-05