辛伐他汀通過Akt／eNOS途徑改善心肌梗死后急性期心功能

朱喬燕，王光宇，2，畢亞光，2，張慶勇，魏 盟

（1．上海市第六人民醫院心血管內科，上海 200233；2．上海交通大學醫學院，上海 200233）

辛伐他汀通過Akt／eNOS途徑改善心肌梗死后急性期心功能

朱喬燕1，王光宇1，2，畢亞光1，2，張慶勇1，魏 盟1

（1．上海市第六人民醫院心血管內科，上海 200233；2．上海交通大學醫學院，上海 200233）

中國圖書分類號：R-332；R322．11；R331．31；R542.22；R972.6

摘要：目的 探討辛伐他汀（simvastatin，Sim）對急性心肌梗死后心肌內源性抗氧化系統的影響及其潛在機制。方法應用結扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法模擬急性心肌梗死（AMI），隨機分為心肌梗死組（MI）組和辛伐他汀組（Sim，20 mg·kg－1·d－1），另設假手術組（Sham組）。Sim組連續灌胃7 d，MI組和Sham組給予等劑量的生理鹽水灌胃。7 d后，觀察心肌血流動力學參數變化；檢測血脂及心肌壞死標記物肌鈣蛋白I（c-TnI）和乳酸脫氫酶（LDH）變化；ELISA法檢測心肌抗氧化系統超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GP）水平。Western blot檢測心肌p-Akt／p-eNOS蛋白表達變化。結果 急性心肌梗死明顯降低心肌血流動力學參數，增加血清c-TnI和LDH水平，降低SOD及GP水平，降低p-Akt和p-eNOS蛋白表達。Sim組能明顯改善急性期心功能惡化，減低血清c-TnI和LDH水平，增加SOD及GP水平，增加p-Akt和p-eNOS蛋白表達。結論 急性心肌梗死后早期應用Sim能明顯改善心功能，增加心肌抗氧化系統活性，減少心肌壞死，這可能與提高p-Akt和p-eNOS蛋白表達有關。

關鍵詞：辛伐他汀；心肌梗死；心功能；氧化應激；急性期；p-Akt；p-eNOS

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．020．html

他汀類藥物（statins），羥甲基戊二酰輔酶A （HMG-CoA）還原酶抑制劑，已成為臨床上治療高脂血癥和降低心血管疾病發病率及死亡率的一線藥物。大型臨床數據研究發現，急性心肌梗死后（AMI）早期使用他汀類藥物能明顯提高AMI后1年生存率［1］。近年研究發現，他汀類藥物的一些額外收益并非完全歸功于其降低血脂作用［2］。臨床數據和基礎實驗已經證實在發生心衰情況下，活性氧類物質增多，其參與脂質過氧化物的形成，破壞細胞膜，降低內源性的抗氧化防御系統［3－4］。因此，通過有效的干預手段抑制自由基的產生或增強抗氧化防御系統或許可以改善心功能。

近來實驗發現，絲氨酸／蘇氨酸激酶（Akt）及其下游靶蛋白eNOS（內皮型一氧化氮合酶）參與調控缺血組織血管再生及改善缺血組織血流動力學異常改變［5－7］。但是在AMI情況下，辛伐他汀對內源性抗氧化系統的影響還鮮有報道，同時對他汀類藥物心肌保護作用的研究大多數集中在心梗后重構期［8］。所以本實驗制作大鼠急性心肌梗死模型，觀察辛伐他汀對急性期內源性抗氧化系統的影響及其與Akt／eNOS通路的關系，探討辛伐他汀改善心肌梗死后急性期心功能的潛在分子機制。

1　材料與方法

1．1藥物與試劑 辛伐他汀（批號100035）由默沙東公司提供；抗磷酸化的Akt（p-Aktser473）及磷酸化的eNOS（p-eNOSser1177）購自Cell Signaling Technolo-gy公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；化學發光試劑購自Millipore公司。SOD與GP試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1．2動物模型建立與分組 健康SD♂大鼠（上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供），體質量200 ～250 g。將5%戊巴比妥鈉（40 mg·kg－1）腹腔注射麻醉大鼠，背位固定，行氣管切開并連接到微型動物呼吸機（ALC-V8，上海奧爾科特生物科技有限公司）行呼吸支持，使用GE Pruka Mac-Lab2000心電生理工作站（GE，美國）實時記錄常規肢體導聯及V1、V3、V6胸前導聯心電圖。于大鼠胸骨左緣第3 －4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包膜，于左心耳及肺動脈圓錐之間距左心耳下緣1－2 mm處穿線（6／0絲線）結扎冠狀動脈左前降支。結扎成功的標志：心電圖Ⅱ導聯J點明顯抬高和結扎線以下心肌組織顏色由正常變蒼白。另設假手術組（Sham組，n＝12），在相同位置只掛線不結扎。24 h后存活的SD大鼠隨機分為心肌梗死組（MI組，n＝12），辛伐他汀組（Sim組，n＝12，20 mg·kg－1·d－1），劑量參考文獻［8］。Sim組術后24 h以辛伐他汀（批號100035，默沙東公司）灌胃，連續7 d。Sham組和MI

組以等量的生理鹽水灌胃。

1．3血流動力學測定 7 d后以同樣的方法進行腹腔麻醉。分離右頸總動脈，經右頸總動脈插入PE-20導管至左心室，導管另一端經能量轉換器連接MPA-2000生理記錄儀，測定心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓力最大上升和下降速率（±LVdp／dtmax）。

1．4血脂、心肌損傷標記物及抗氧化系統標記物測定 血流動力學測定完之后開腹，在腹腔靜脈處取血5 mL，離心取上清送至上海市第六人民醫院檢驗科，測定膽固醇（TG）、甘油三酯（TC）、肌鈣蛋白I （c-TnI）、乳酸脫氫酶（LDH）水平，同時用ELISA試劑盒測定超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GP）水平。

1．5Western blot檢測心肌p-Akt／p-eNOS的表達提取心肌蛋白樣本，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調至等濃度后加入上樣緩沖液混合，離心后上樣。恒壓80 V電泳，30 min后改為恒壓120 V至電泳結束。將蛋白轉至PVDF膜上（恒流250 mA，4℃轉膜2 h），用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入相應一抗，在搖床上4℃孵育過夜，0.1%TBST洗膜3次后加相應二抗室溫孵育2 h，洗膜后顯色，使用凝膠成像系統拍照分析，計算各條帶OD值，以靶蛋白與內參蛋白的OD值比值代表相應蛋白的表達量。

1．6統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差檢驗，兩兩比較分析采用LSD-q檢驗。

2　結果

2．1各組血流動力學比較 與Sham組相比，MI組LVEDP明顯升高，LVdp／dtmax，LVdp／dtmin及LVSP卻明顯降低（P＜0.05）。與MI組相比，Sim組明顯改善心功能，逆轉血流動力學這些異常指標（P＜0.05）。HR在各組間差異無統計學意義（P＞0.05），見Tab 1。

2．2各組大鼠血脂比較 與Sham組相比，MI組TG和TC均呈上升趨勢，但差異未達到統計學意義（P＞0.05）。與MI組相比，Sim組TG和TC呈下降趨勢，差異也未達到統計學意義（P＞0.05）。

2．3各組心肌損傷標記物及抗氧化系統標記物測定 與Sham組相比，MI組血清c-TnI和LDH水平明顯升高（P＜0.05），與MI組相比，Sim組c-TnI和LDH水平明顯降低（P＜0.05），但較Sham組升高（P＜0.05）。與Sham組相比，MI組血清SOD和GP水平明顯降低（P＜0.05），與MI組相比，Sim組SOD和GP水平明顯升高（P＜0.05），但較Sham組降低（P＜0.05），見Tab 2。

Fig 1 Effect of simvastatin on lipid level in rats（n＝12）

2．4Western blot檢測各組心肌p-Akt和p-eNOS水平變化 與Sham組相比，MI組p-Akt水平明顯降低（P＜0.05），與MI組相比，Sim組p-Akt水平明顯升高（P＜0.05）。與Sham組相比，MI組p-eNOS水平明顯降低（P＜0.05），與MI組相比，Sim組p-eNOS水平明顯升高。

Tab 1 Effect of simvastatin on hemodynamics parameters in rats（±s，n＝12）

Tab 1 Effect of simvastatin on hemodynamics parameters in rats（±s，n＝12）

P＜0.05 vs Sham group；＃P＜0.05 vs MI group

Group　LVSP／kPa　LVEDP／kPa　LVdp／LVdtmax／kPa·s－1　LVdp／LVdtmin／kPa·s－1　HR／bpm·min－1Sham　15．86±0．98　0．39±0．09　1243．82±104．51　810．06±78．51　438．00±5．20 MI　12．26±0．88　0．77±0．15　739．95±28．39　574．12±30．66　456．00±19．40 Sim　15．32±0．79＃　0．43±0．11＃　1179．44±79．98＃　785．27±94．78＃451．00±13．10

Tab 2 Effect of simvastatin on myocardial injury and antioxidant system markers in rats（±s，n＝12）

Tab 2 Effect of simvastatin on myocardial injury and antioxidant system markers in rats（±s，n＝12）

P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs MI

Group　c-TnI／ng·L－1LDH／U·L－1SOD／U·L－1　GP／U·L－1Sham　750±230　6122±120　325±15　8327±674 MI　18210±8670　8562±236　184±21　5458±745Sim　8530±3960＃　7383±153＃　241±14＃　7247±695＃

Fig 2 Effect of simvastatin on p-Akt and p-eNOS expression in rats（n＝12）

3　討論

本實驗觀察到急性心肌梗死后急性期心功能明顯降低，LVSP，±LVdp／LVdtmax明顯降低，LVEDP升高，用辛伐他汀20 mg·kg－1連續灌胃7 d可以明顯改善心功能。急性心肌梗死后，細胞壞死釋放大量肌鈣蛋白I［9－10］，急性心肌梗死后使用辛伐他汀可以明顯降低c-TnI水平［11］。LDH也是診斷心肌損傷的標志物，當細胞膜通透性升高或者破裂，胞質內的LDH就會釋放到細胞外，血清濃度也隨之升高。前期研究也表明發生心肌梗死大鼠，血清LDH濃度會明顯升高，本次研究結果和前期研究結果一致［12］。使用辛伐他汀可以明顯減少LDH水平，表明辛伐他汀可以保持細胞膜完整性，從而限制胞質內LDH外溢。所以，辛伐他汀改善心功能或許和穩定細胞膜完整相關，減少心肌細胞的破壞。

急性心肌梗死可引起嚴重的氧化應激反應，進而導致心肌細胞的壞死。活性氧類物質的增多或者抗氧化防御系統能力的減弱都會加重心肌細胞的壞死，加重心肌病理生理變化［13］。Zhou等［14］報道氟伐他汀可以減少心肌細胞氧化物質產生，增加抗氧化系統性能。這和此次試驗結果一致，SOD和GP 在MI組都明顯降低，辛伐他汀處理可以明顯提升SOD和GP水平，表明急性期使用辛伐他汀可以增強內源性抗氧化防御系統，加快應激狀態下自由基的清除，減少心肌損傷，從而改善心梗急性期心功能，此外也表明辛伐他汀的心臟保護作用機制可能與增加SOD和GP水平有關。

蛋白激酶B（PKB／Akt）是一種多功能調控因子，參與內皮細胞的生長、生存等調節。在缺血／再灌注動物模型中，激活Akt可以減少心肌細胞凋亡［15］。Kureishi等［7］研究表明，在正常血脂的動物中，辛伐他汀可以明顯改善缺血肢體的血流動力學參數，促進血管再生。進一步研究發現，Akt／eNOS信號通路在此過程中扮演著舉足輕重的作用。在本次實驗中，我們也觀察到辛伐他汀改善急性期心肌梗死大鼠血流動力學參數，同時也發現辛伐他汀組提高p-Akt和p-eNOS水平。所以據此推測辛伐他汀促進心梗后大鼠心肌Akt激活，從而使血管內皮細胞生成NO增加，促進血管擴張，增加缺血心肌的灌注，從而改善心功能。NO還可以抑制血小板的聚集、炎癥反應和平滑肌細胞增殖。此外，Akt是血管內皮細胞生長因子（VEGF）下游靶蛋白，在Kure-ishi等研究中發現激活Akt發揮血管再生作用，因此，在本次實驗中不能排除Akt也發揮同樣的作用進而改善心功能。故激活Akt途徑加快再內皮化和增加NO合成體現了心肌梗死早期使用他汀類藥物保護益處。總之，這些潛在的心臟保護作用機制或許可以部分解釋辛伐他汀改善急性期心功能的分子機制。當然還有其他許多機制，如辛伐他汀減少心梗后心肌細胞凋亡和減輕心肌細胞水腫參與心功能

的改善［16］。

綜上所述，本實驗證實辛伐他汀對心肌梗死大鼠急性期具有重要的保護作用，增加血清SOD和GP水平，降低c-TnI和LDH水平和激活Akt／eNOS信號通路都參與其中。這為早期使用他汀類藥物治療急性心肌梗死改善心功能提供了重要的實驗依據。至于辛伐他汀調節Akt磷酸化和Akt促進eNOS磷酸化增加NO釋放的具體過程還是不清楚，需要以后的進一步研究。

（致謝：本文所有實驗過程及數據都是在上海市第六人民醫院心血管內科實驗室完成，在此感謝實驗室研究員卿艷維老師在實驗中給予的幫助。）

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Simvastatin improves cardiac function in acute phase after myocardial infarction through Akt／eNOS pathway

ZHU Qiao-yan1，WANG Guang-yu1，2，BI Ya-guang1，2，ZHANG Qing-yong1，WEI Meng1
（1．Cardiovascular Dept，the Sixth People’s Hospital of Shanghai，Shanghai 200233，China；2．Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200233，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of simvastatin （Sim）on endogenous antioxidant system after acute myocardial infarction（AMI）and its potential mecha-nisms．Methods The acute myocardial infarction （AMI）rat models were made by ligation left anterior descending of coronary artery．Then the successful models were randomly divided into myocardial infarc-tion group（MI group）and simvastatin group（Sim，20 mg·kg－1·d－1），another group without ligation left anterior descending of coronary artery served as sham group（Sham group）．The Sim group was administered simvastatin by gavage for 7 days．MI group and Sham

group received saline．Hemodynamic parameters，lipid levels，troponinI（c-TnI）and lactate dehydrogenase （LDH）concentrations were examined after 7days，and the levels of superoxide dismutase（SOD）and glutathi-one peroxidase（GP）of myocardial antioxidant system were detected by ELISA．The expression of cardiac p-Akt and p-eNOS protein were detected by Western blot．Results Acute myocardial infarction significant-ly lowered cardiac hemodynamic parameters，increased serum c-TnI and LDH levels，lowered levels of SOD and GP，and lowered the expression of p-Akt and p-eNOS protein．However，Sim could effectively prevent the deterioration of cardiac function，reduce serum c-TnI and LDH levels，increase levels of SOD and GP，and increase p-Akt and p-eNOS protein expression．Conclusion Early using Sim can effectively improve heart function after acute myocardial infarction，acti-vate myocardial antioxidant system，and reduce myocar-dial necrosis，which may be related to increasing the expression of p-Akt and p-eNOS．

Key words：simvastatin；myocardial infarction；cardi-ac function；oxidative stress；acute phase；p-Akt；p-eNOS

作者簡介：朱喬燕（1981－），女，碩士，研究方向：心律失常發病機制，E-mail：513387804＠qq．com；張慶勇（1972－），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：糖尿病心律失常發病機制，E-mail：zhang＿qingyong71＠hotmail．com

基金項目：上海自然科學基金資助項目（No 13ZR1431500）

收稿日期：2015－05－11，修回日期：2015－08－16

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1375－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．010