蛇床子素對感染APP基因的神經元突觸的保護作用

李少恒，教亞男，姚瓔珈，孔 亮，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻

（遼寧中醫藥大學藥學院藥理學教研室，遼寧大連 116600）

蛇床子素對感染APP基因的神經元突觸的保護作用

李少恒，教亞男，姚瓔珈，孔 亮，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻

（遼寧中醫藥大學藥學院藥理學教研室，遼寧大連 116600）

中國圖書分類號：R284.1；R329.25；R338.1；R745.702.2

摘要：目的 探討蛇床子素（osthole，Ost）對感染APP（amy-loid precursor protein）基因的神經元突觸的保護作用及其機制。方法 將培養的神經元分為對照組（感染GFP組）、模型組（感染APP組）和給藥組（Ost＋APP組）。通過感染含有突變位點的APP基因來模擬阿爾茨海默病，CCK-8法檢測神經元的存活能力，免疫熒光化學法對突觸素-1（synap-sin-1，SYN）染色，ELISA法檢測神經元突觸內突觸后膜蛋白-95（PSD-95）和突觸體素（synaptophysin，SYP）蛋白的濃度，Western blot法檢測Aβ1－42、鈣調蛋白激酶激酶2（calci-um／calmodulin-dependent protein kinase kinase 2，CAMKK2）、磷酸化單磷酸腺苷活化蛋白激酶α1（5’-adenosine mono-phosphate-activated protein kinaseα1，p-AMPKα1）、AMPKα1的蛋白表達。結果 感染APP的神經元顯現較強的APP陽性，并生成有神經毒性的Aβ1－42。與模型組比較，給藥組明顯增強神經細胞的存活能力，增加synapsin-1的表達量，提高PSD-95和SYP的濃度，降低CAMKK2、p-AMPKα1蛋白的表達。結論 蛇床子素對感染APP基因的神經元突觸造成的損傷具有保護作用，此神經保護作用可能是與抑制CAMKK2／AMPK信號通路有關。

關鍵詞：蛇床子素；神經元；突觸；感染；阿爾茨海默病；CAMKK2／AMPK信號通路

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．024．html

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，隨著人口老齡化進程的加快，其影響已經不容忽視，其主要臨床表現為進行性認知功能障礙、記憶力衰退、語言以及社會適應程度的改變［1］。研究表明［2］，Aβ沉積可導致神經元突觸缺失及神經功能退化，但是目前還沒有明顯有效的治療手段。蛇床子素（（7-methoxy-8-isopentenoxycoumarin，C15H16O3，osthole，Ost）是從傘形科植物如獨活和蛇床子等提取分離出來的香豆素類化合物［3］。許多研究證明，Ost具有抗氧化、抗凋亡等神經保護作用［4－6］。本研究采用含有突變位點的APP（amyloid precursor protein）基因感染神經元來構建體外AD細胞模型，觀察Ost對感染APP形成Aβ沉積導致神經元突觸功能的影響并探討其機制。

1　材料與方法

1．1動物 清潔級昆明種小鼠，購于遼寧長生生物有限公司，許可證號：SCXK（遼）：2010－0001，取新生48 h內小鼠用于實驗。

1．2試劑 蛇床子素購于成都普菲德生物有限公司（純度＞98%，批號：JOT-10359），溶于二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司），終濃度＜0.01%，用DMEM（Dulbecco′s modified eagle medi-um，Gibco公司）培養液配成各濃度待用。胎牛血清（fetal calf serum，FBS，Gibco公司），青－鏈霉素（penicillin-strepotomycin，P／S，Thermo公司），一抗分別為兔抗NF-M、APP、Aβ1－42、synapsin-1、CAMKK2、p-AMPKα1、AMPKα1、β-actin（北京博奧森）；二抗為Cy3標記驢抗兔IgG（Jackson）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG（北京鼎國）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylin-dole，DAPI）染液（Sigma），Cell Counting Kit CCK-8試劑盒（Dojindo），全蛋白提取試劑盒（南京凱基），5 ×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（南京凱基），ECL檢測試劑盒（南京凱基）。

1．3儀器 Ti-S型熒光顯微鏡（日本尼康）、超低溫冰箱（青島海爾，DIV-86L386）、CO2培養箱（NU-AIRE，BPN）、酶標儀（深圳邁瑞，MR-96A）、紫外－可見光分光光度計（上海元析，UV-5600）、PCR儀（杭州朗基，MG96G）、凝膠成像系統（UVP，GeneGe-nius）、水平核酸電泳儀（Bio-Rad）、半干式蛋白轉膜儀（Bio-Rad）。

1．4神經元的分離、培養與鑒定 取新生（48 h內）小鼠大腦并分離出大腦皮層，剪碎并用0.05%胰蛋白酶于37℃消化15 min，終止消化后經篩網過濾，得到細胞懸液。細胞懸液以5×109·L－1的密

度接種于經多聚賴氨酸包被過的24孔板中，培養于含有10%FBS和1%P／S的DMEM完全培養基中，置于37℃，5%CO2－95%空氣培養箱中培養。3～4 d后加入4 mg·L－1的阿糖胞苷，48 h后更換新的培養基，以后每3 d半量換液。培養14 d后用兔抗NF-M抗體進行免疫熒光染色，并在倒置熒光顯微鏡下進行觀察鑒定［7］。

1．5APP基因轉染神經元及APP表達的檢測將委托北京奧科生物技術有限公司合成含突變位點的APP基因片段用XbaI和NotI雙酶切后插入同樣酶切的System Biosciences（SBI）公司的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的目標載體構建為慢病毒載體，按實驗室所述方法［8－9］按一定比例將其轉染293T（天津醫科大學）包裝細胞，對照組轉染GFP。培養293T細胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察兩組細胞都呈現綠色熒光。分別收集72 h內上述293T細胞培養液上清（含病毒），離心、濃縮并檢測病毒滴度；用濃縮的病毒上清感染12 d的神經元；感染3 d后，用免疫細胞化學法檢測APP在神經元中的表達。

1．6實驗分組 對照組：感染GFP的神經元；模型組：感染APP-GFP共表達的神經元；給藥組：給予24 h不同濃度（10、50、100 μmol·L－1）Ost的感染APP-GFP共表達的神經元。

1．7CCK-8檢測細胞的活力 CCK-8試劑中含有的WST-8在電子偶合試劑存在的作用下，被細胞中線粒體內的脫氫酶還原為具有水溶性的黃色甲產物。使用酶標儀在450 nm處測吸光度值來反映活細胞數量。故而將神經元以5×109·L－1的密度接種于經多聚賴氨酸包被過的96孔板中，并以上述分組每組設3個復孔。培養15 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4 h，并在450 nm處檢測吸光度。

1．8免疫熒光細胞化學法觀察各組細胞synapsin-1表達 經過分組處理的各組神經元，棄去培養基，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，1×PBS洗3次；1%Triton X-100通透30 min，1×PBS洗3次；加入兔抗synapsin-1（1∶150）4℃孵育過夜；1×PBS洗3次，加入Cy3標記驢抗兔lgG（1∶150）孵育1 h；1× PBS洗3次，加入DAPI染色液（1∶50）孵育15 min。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1．9ELISA法檢測各組細胞PSD-95和SYP蛋白的表達 收集分組處理的各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書所示方法，利用酶標儀檢測各組在450 nm處的吸光度。

1．10Western blot檢測Aβ1-42、CAMKK2、p-AMPKα1、AMPKα1的蛋白表達水平 原代培養的神經元，經各組處理后，用冷的PBS沖洗，立即放入預冷的裂解緩沖液中，12 000 r·min－1，離心15 min，取上清，用BSA法測定蛋白質含量，將各組蛋白質濃度調成一致。用10%的分離膠分離蛋白，每個泳道蛋白質上樣量為50 μg。電泳后將凝膠中的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入含5%BSA的TBST中封閉30 min，再用TBST緩沖液洗膜3次。將膜放入裝有兔抗Aβ1－42、CAMKK2、p-AMPKα1、AMPKα1、β-actin（1∶1 000）抗體的自封袋中，4℃孵育過夜；TBST沖洗3次，將膜放入HRP標記的山羊抗兔的二抗（1∶2 000）中，室溫孵育1 h，然后用TBST洗膜3次；按試劑盒配制ECL工作液，暗室中將處理好的膜片放入ECL工作液中，反應1-3 min至蛋白的熒光條帶可見終止顯色；凝膠成像儀觀察顯色情況，拍照記錄，并用Image J軟件分析相對灰度。相對灰度＝灰度目的蛋白／灰度β-actin。

1．11統計學分析 采用SPSS 17．0版統計軟件對數據進行處理，所有數據均以±s表示，組間采用t檢驗或單因素方差分析。

2　結果

2．1神經元的培養與鑒定 顯微鏡下觀察培養3 d后發現細胞已有神經元形態，大部分已發出突起。14 d后神經元較成熟，經免疫熒光染色可見，神經元胞體飽滿，突起較長，連接較緊密（Fig 1）。

Fig 1 Neurons identified by immunofluresence

Fig 2 Accessed of APP and Aβ1-42expression in lentivirus infected neurons

2．2檢測APP基因在神經元中的表達及Aβ1－42的生成 免疫熒光細胞化學法檢測經感染3 d后的神經元，結果顯示，感染了APP-GFP共表達的神經元和感染了GFP的神經元都明顯表達GFP（綠色），效率達95%以上，說明感染成功；但APP（紅色）只在APP感染的神經元中明顯表達，而在對照組中幾乎不表達（Fig 2A）。Western blot結果顯示（Fig 2B），感染了APP-GFP共表達的神經元的Aβ1－42蛋白表達水平較對照組明顯升高（P＜0.01），證實了體外構建AD細胞模型的成功。

2．3Ost增強感染APP基因的神經元的存活能力如Fig 3所示，與對照組相比，模型組的細胞存活率為57.4%（P＜0.01）；而給予了不同濃度Ost的給藥組的細胞存活率明顯升高（P＜0.01），且以給予50 μmol·L－1Ost的實驗組細胞活力更為明顯。因此，以下實驗均以給予50 μmol·L－1Ost作為給藥組（簡稱Ost組）。

Fig 3 Comparison of cell viability among all groups by CCK-8

2．4Ost對感染APP基因的神經元synapsin-1表達的影響 通過免疫熒光結果（Fig 4A）發現，對照組的synapsin-1陽性表達較多，突觸形態比較明顯。模型組的synapsin-1的熒光強度較弱為（57.00± 3.21）%（與對照組相比），而給予Ost對synapsin-1的表達明顯增強，熒光強度達到（79.10±4.01）%，差異具有顯著性（Fig 4B）。說明Ost可對抗感染APP所引起的synapsin-1的減少。

Fig 4 Comparison of expression of synapsin-1 among all groups

2．5Ost對感染APP基因的神經元的PSD-95和SYP表達的影響 ELISA結果顯示（Fig 5），相比于對照組，模型組的PSD-95和SYP分別下調了44.7 μg·L－1與3.2 μg·L－1（P＜0.01）；而給予了Ost的給藥組與模型組相比2種突觸相關蛋白分別上調了20 μg·L－1與2.3 μg·L－1（P＜0.01）。說明Ost對感染APP造成的突觸功能損傷具有保護作用。

Fig 5 PSD-95 and SYP concentrations measured by ELISA assay

2．6Ost調節感染APP基因的神經元內CAMKK2／AMPK通路相關蛋白的表達 根據Western blot結果可知（Fig 6），與對照組相比，模型組的CAMKK2、p-AMPKα1蛋白的表達量明顯增多（P＜0.01），但對AMPKα1無明顯影響；而給藥組與模型組比較而言，CAMKK2下降明顯（P＜0.05），p-AMPKα1下降明顯（P＜0.01），對AMPKα1無影響。

3　討論

阿爾茨海默病是一種神經退行性疾病，主要集中在中老年時期發病。以β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑（SP）、細胞骨架蛋白tau的高度磷酸化產生的神經纖維纏結（NFTs）以及神經元和突觸的缺失等為主要病理特征［10－12］。研究證實，由于位于21號染色體上的APP基因突變可生成具有神經毒性的Aβ42，所以筆者采用具有突變位點的APP基因轉染神經元模擬AD來進行實驗。

Fig 6 Comparison with relative protein expression of CAMKK2／AMPK

突觸是兩個神經元之間的緊密接觸并形成特殊結構的功能接觸部位，在傳遞信息方面起重要的作用。研究表明，多種突觸相關蛋白一起來維持突觸的功能并調控神經遞質的釋放，其中synapsin-1、SYP位于突觸前膜，是有代表性的與突觸囊泡相關的蛋白，主要調節神經遞質的釋放；PSD-95作為重要的骨架蛋白在突觸興奮和維持突觸結構和功能可塑性上發揮著重要的作用［13－14］。研究表明，突觸相關蛋白含量的降低與突觸的丟失是AD的典型現象［15］。因此本實驗在造模成功的基礎上用synap-sin-1染色來顯示觀察突觸的密度和分布情況，ELISA檢測相關蛋白PSD-95和SYP的表達。最后發現Ost能明顯逆轉感染APP引起的突觸相關蛋白的降低，說明Ost能對抗感染APP引起的突觸損傷和丟失。

CAMKK2／AMPK信號通路是Aβ42誘導突觸毒性過程中非常重要的調控因子，有毒性的Aβ沉積刺激了特定的神經元受體，該受體使Ca2＋大量內流從而激活了CAMKK2酶，繼而激活了AMPK，作為其中的蛋白質亞型α1上的172位蘇氨酸（Thr172）

的磷酸化是AMPK激活的主要機制［16－19］。所以本實驗從CAMKK2與pT172-AMPKα1入手來探討Ost對神經元突觸的保護作用，最后Western blot結果發現模型組的CAMKK2與p-AMPKα1蛋白表達量明顯升高（P＜0.01），Ost組的蛋白表達量較模型組明顯降低，差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）。綜上所述，Ost有可能通過抑制CAMKK2／AMPK信號通路來逆轉Aβ對神經元突觸造成的損傷與丟失，但是具體的機制需要進一步研究。

（致謝：實驗在導師楊靜嫻教授的精心指導，師兄師姐們的熱情幫助下順利進行，論文也在閆老師的辛苦修改下順利完成。）

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Neuroprotective effect of osthole on neuron synapses infected APP gene

LI Shao-heng，JIAO Ya-nan，YAO Ying-jia，KONG Liang，TAO Zhen-yu，YAN Yu-hui，YANG Jing-xian
（Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Liaoning Unversity of Traditional Chinese Medicine，Dalian Liaoning 116600，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of osthole onneuron synapses infected APP gene and its underlying

mechanism．Methods The neurons were divided into three groups：GFP，APP，APP＋Ost groups．The neu-rons were infected APP gene with containing mutational site in vitro for mimicking the characterstics of Alzhei-mer’s disease（AD）．The cell viability was assessed by CCK-8，the expression of synapsin-1 was deter-mined by immunofluorescence，and the concentration of PSD-95 and SYP were detected by ELISA．The ex-pressionsof Aβ1-42，CAMKK2，phoshorylated AMPKα1，AMPKα1 protein were determined by West-ern blot．Results Strong APP staining was visible in neurons infected with APP and abundant expression of Aβ1-42，a neurotoxic oligomer．Compared with APP group，APP＋Ost group significantly increased cell vi-ability，promoted the expression of synapsin-1，up-reg-ulated the concentration of PSD-95 and SYP，and de-creased the expressions of CAMKK2 and p-AMPKα1．Conclusions Ost can protect the neuron synapses a-gainst infected with APP gene．Its neuroprotective effect may be related to inhibiting the CAMKK2／AMPK signal pathway．

Key words：osthole；neurons；synapses；infection；Alzheimer’s disease；CAMKK2／AMPK signal pathway

作者簡介：李少恒（1992－），男，碩士生，研究方向：中藥神經藥理學，E-mail：lsh199242＠163．com；楊靜嫻（1963－），女，博士，教授，博士生導師，研究方向：神經藥理學，通訊作者，Tel：0411-87586009；E-mail：jingxianyang＠yahoo．com

基金項目：國家自然科學基金面上項目（No 81173580）

收稿日期：2015－06－29，修回日期：2015－08－12

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1383－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．012