二苯乙烯苷抑制異丙腎上腺素誘導小鼠心肌纖維化及其機制研究

曾 翼，王 霏，許曉樂

（1．南通大學藥學院藥理學教研室，江蘇省炎癥與分子藥靶重點實驗室，江蘇南通 226001；2．南通大學附屬醫院心胸外科實驗室，江蘇南通 226001）

二苯乙烯苷抑制異丙腎上腺素誘導小鼠心肌纖維化及其機制研究

曾 翼1，王 霏2，許曉樂1

（1．南通大學藥學院藥理學教研室，江蘇省炎癥與分子藥靶重點實驗室，江蘇南通 226001；2．南通大學附屬醫院心胸外科實驗室，江蘇南通 226001）

中國圖書分類號：R-332；R322．11；R542.230.22；R977.6

摘要：目的 觀察二苯乙烯苷（2，3，4′，5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D glucoside，TSG）對異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導的小鼠心肌纖維化的作用及其相關機制。方法 采用連續皮下注射異丙腎上腺素14 d誘導小鼠心肌纖維化模型，同時以TSG（120、60、30 mg·kg－1）和陽性對照卡托普利（40 mg·kg－1）灌胃給藥。末次給藥12 h后，取心室肌進行蘇木精伊紅（hematoxylineosin，HE）染色和Masson染色，觀察纖維化的程度；測定心肌羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量；檢測心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原，轉化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）的蛋白表達水平；測定心肌組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase-Px，GSH-Px）活性。結果 與正常對照組相比，模型組心肌出現明顯纖維化，心肌組織HYP水平明顯增高，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達明顯增加。與模型組相比，TSG能減輕心肌纖維化程度，降低心肌組織HYP水平及心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達。同時，TSG降低心肌組織中TGF-β1的蛋白表達，且能升高損傷心肌組織中SOD和GSH-Px的活性。結論 TSG可抑制ISO誘導的小鼠心肌纖維化，其機制可能與調節TGF-β1蛋白表達及其抗氧化有關。

關鍵詞：二苯乙烯苷；異丙腎上腺素；心肌纖維化；膠原；轉化生長因子-β1；氧化應激

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．026．html

心肌纖維化是指在心肌的正常組織結構中膠原纖維過量積聚，膠原濃度明顯升高，各型膠原比例失調以及排列紊亂等［1］。它是多種心臟疾病發展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構的主要表現之一。基于心肌纖維化已成為慢性心功能不全難以逆轉的原因之一，常導致嚴重的后果，因此研究切實有效的防治措施具有十分重要的意義。

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG）簡稱二苯乙烯苷，是何首烏的主要藥效成分，已被證實對心血管系統有一系列有效作用，如：TSG能降低血脂［2］、抑制動脈粥樣硬化進程［3］、修復血管內皮［4］、抑制血管平滑肌細胞增殖及內膜增生［5－6］、對

心肌細胞具有保護作用［7］。但TSG對心肌纖維化作用尚在進一步探討中。本實驗首次研究TSG對異丙腎上腺誘導的小鼠心肌纖維化的作用及其相關機制，為TSG的開發和臨床應用提供理論和實驗依據。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1動物 昆明種小鼠，♂，體質量（20±2）g，SPF級，由南通大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK9（蘇）2002－0022。

1．1．2藥品及試劑 二苯乙烯苷口服液由南通大學醫學院中藥研究室提取提供，含量＞95%（HPLC法），批號20130702；異丙腎上腺素購于上海禾豐制藥有限公司，批號130701；卡托普利購于上海衡山藥業有限公司，批號120308；羥脯氨酸（hydroxypro-line，HYP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase-Px，GSH-Px）檢測試劑盒購于南京建成生物公司；膠原Ⅰ型（CollagenⅠ）和膠原Ⅲ型（CollagenⅢ）一抗購于Proteintech Group公司；轉化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）一抗購于巴傲得生物科技有限公司公司；內參GAPDH購于康成生物；鼠抗、兔抗等二抗均購自Odessey公司；山羊血清封閉液購于EATAR公司；Cy3標記山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液均購于碧云天公司。其它試劑均為國產分析純。

1．1．3儀器 PowerWave340酶標儀（美國Bio-TEK公司）、紅外雙色激光成像系統掃描儀（美國Odes-sey公司）、電泳及轉印裝置（美國BIO-RAD公司）、冰凍切片機（LEICA CM1900）。

1．2方法

1．2．1動物模型制備 小鼠背部皮下注射異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO），首次劑量為40 mg· kg－1，d 2劑量為20 mg·kg－1，d 3劑量為10 mg· kg－1，d 4劑量為5 mg·kg－1，并以此劑量再維持10 d，自由進食、給水，對照組小鼠皮下注射相同體積的生理鹽水［8］。

1．2．2給藥和分組 小鼠隨機分為6組，即正常對照組、模型組、二苯乙烯苷高、中、低劑量組（120，60，30 mg·kg－1）、卡托普利組（40 mg·kg－1）。每組10只。給藥組小鼠連續灌胃14 d，對照組和模型組給予相同體積的生理鹽水。實驗期間，未見被觀察動物死亡。

1．2．3心肌組織病理學檢查 末次給藥12 h后，頸椎脫臼處死小鼠，用冷生理鹽水清洗小鼠心臟組織，濾紙吸干，取左室心肌組織，4%多聚甲醛固定，HE和Masson染色制片，鏡下觀察心肌細胞變性、炎癥浸潤、膠原纖維增生程度等組織形態學變化，用Image Pro Plus 6．0軟件對圖像進行分析，計算心肌膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）。CVF為膠原的面積占總面積的比值。

1．2．4Weston blot檢測 取各組新鮮大鼠左室心肌組織，提取蛋白，采用BCA比色法進行蛋白定量。加上樣緩沖液，100℃變性5 min。每孔50 μg蛋白上樣，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，加入一抗稀釋液，4℃過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育2 h，顯影。以GAPDH為內參照，測定各組蛋白表達量與內參表達量的比。

1．2．5免疫熒光檢測小鼠心肌組織中TGF-β1的表達 取各組心肌組織包埋后行冰凍切片，每片5 μm厚，室溫風干。將切片放入已沸騰的檸檬酸緩沖液中，中檔微波處理10 min，取出微波盒，流水冷卻，取出玻片，用蒸餾水沖洗2次，再用PBS沖洗2次。每張切片加10～20 μL山羊血清，37℃封閉20 min。除去多余血清，加入TGF-β1一抗，37℃孵育1 h。PBS洗滌3次。空白對照組中用PBS代替一抗。每張切片加入Cy3標記山羊抗兔IgG，37℃避光孵育1h。PBS洗滌3次。蒸餾水浸洗1 min。用50%甘油封片，熒光顯微鏡觀察。Image Pro Plus 6．0軟件測量每張切片陽性表達顆粒的積分光密度（inte-gral optical density，IOD）值。

1．2．6心肌組織HYP、SOD及GSH-Px測定 取適量的組織樣品，然后準確稱重。按照重量體積比1∶9加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰浴中用玻璃勻漿器制備10%組織勻漿，3 000 r·min－1，離心10 min，取上清即待用。心肌組織HYP、SOD及GSH-PX測定分別按照相關檢測試劑盒的說明書操作。

2　結果

2．1小鼠心肌組織HE和Masson染色結果 HE染色結果顯示，正常組心肌纖維均勻致密，排列整齊，無心肌纖維破壞，橫紋清晰，核居中，間質未見明顯血管擴張及炎細胞浸潤。模型組心肌細胞灶狀變性、壞死，壞死灶內及周圍心肌間質可見大量炎細胞浸潤，心肌細胞橫徑稍大，心肌纖維斷裂，心肌細胞間隙明顯增寬，間質水腫，血管周圍和心肌細胞間可

見明顯纖維結締組織增生。給藥組均能不同程度地減輕心肌細胞損傷，即心肌細胞變性、壞死及纖維化程度減輕，炎細胞浸潤程度降低，間質水腫減輕。與低劑量組相比，二苯乙烯苷高劑量組改善的更為明顯（Fig 1）。

Fig 1 HE staining of myocardial tissues（200×）

經Masson特殊染色后，光鏡下可見心肌被染成紅色，心肌間質膠原纖維被染成藍色。與正常對照組相比，模型組心肌細胞間膠原纖維增生明顯，CVF值明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，二苯乙烯苷能抑制心肌細胞間膠原纖維增生，尤其是高劑量組CVF值明顯降低（P＜0.01）（Fig 2）。

2．2二苯乙烯苷對小鼠心肌組織內羥脯氨酸含量影響 小鼠心肌組織內羥脯氨酸檢測結果顯示，與正常對照相比，模型組羥脯氨酸含量明顯升高（P＜0.01）；相較于模型組，二苯乙烯苷120 mg·kg－1劑量組羥脯氨酸含量明顯降低（P＜0.01）（Tab 1）。

2．3二苯乙烯苷對小鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的蛋白表達 Western blot檢測結果顯示，模型組小鼠心臟組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達較正常對照組明顯提高（P＜0.01）；與模型組相比，二苯乙烯苷120 mg· kg－1劑量組的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達均明顯下降（分別P ＜0.01，P＜0.05）（Fig 3）。

Fig 2 Masson specific staining of myocardial tissues（200×）

Tab 1 Effect of TSG on HYP content，SOD and GSH-PX activity of myocardial tissues（±s，n＝10）

Tab 1 Effect of TSG on HYP content，SOD and GSH-PX activity of myocardial tissues（±s，n＝10）

P＜0．01 vs control；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs model

Group Dose ／mg·kg－1HYP ／mg·g－1Pro SOD ／kU·g－1Pro GSH-Px ／kU·g－1Pro Control　－　1．57±0．20　128．52±19．37　228．58±29．27 Model　－　2．48±0．26　79．32±21．65151．16±32．84Captopril　40　1．85±0．19＃＃　114．34±18．31＃＃　207．15±24．15＃＃TSG　120　1．93±0．21＃＃　119．01±19．12＃＃　212．28±29．01＃＃TSG　60　2．27±0．22　104．83±20．78＃　183．14±20．32＃TSG　30　2．33±0．24　83．97±20．07　170．42±33．27

Fig 3 Effect of TSG on protein levels of collagenⅠ（COL-Ⅰ）and collagenⅢ（COL-Ⅲ）（±s，n＝8）

2．4二苯乙烯苷對小鼠心肌組織中TGF-β1蛋白表達的影響 Western blot和小鼠心肌組織免疫熒光檢測結果顯示，模型組TGF-β1的表達明顯高于正常對照組（P＜0.01）；與模型組相比，卡托普利和二苯乙烯苷120 mg·kg－1劑量組明顯下調TGF-β1的表達水平（P＜0.01）（Fig 4）。

2．5二苯乙烯苷對小鼠心肌組織中抗氧化物酶活力的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織中SOD的酶活力明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，TSG 120 mg·kg－1和60 mg·kg－1劑量組均能明顯升高小鼠心肌組織中SOD的酶活力（P＜0.01 或P＜0.05）；與SOD酶活力相似，TSG 120 mg· kg－1和60 mg·kg－1劑量組能抑制異丙腎上腺素引起的小鼠心肌組織中GSH-Px活力的下降（P＜0.01 或P＜0.05）（Tab 1）。

3　討論

心肌纖維化可分反應性纖維化和修復性纖維化。反應性纖維化是壓力超負荷心臟所致，引起心臟收縮及舒張功能不全，最終導致心衰；修復性纖維化主要表現為心肌細胞凋亡壞死、纖維化灶（疤痕）形成并可有心臟功能的異常［9］。我們以往的研究已表明二苯乙烯苷能明顯抑制大鼠腹主動脈結扎致心臟壓力超負荷所復制的反應性心肌纖維化模型［10］。為了全面了解二苯乙烯苷對心肌纖維化的作用，本實驗采用注射異丙腎上腺素建立修復性心肌纖維化模型，觀察二苯乙烯苷對修復性心肌纖維化的作用。

Fig 4 Effect of TSG on TGF-β1 protein expression（±s，n＝8）

大劑量異丙腎上腺素引起心肌細胞變性與壞

死、心肌細胞肥大、膠原纖維增生等超微結構改變類似缺血性心肌壞死，連續用能引起動物心肌肥厚和心肌纖維化，其機制為激活β受體、腎素血管緊張素醛固酮系統，并可能通過多種細胞信號轉導途徑影響纖維化過程［11］。該模型具有心肌纖維化改變出現早、效果穩定持久、簡單易行，為研究心肌修復性纖維化的常用模型。本實驗中，我們給小鼠連續皮下注射異丙腎上腺素2周，病理學檢查顯示，模型組有明顯的膠原纖維增生、斷裂，大量的心肌細胞壞死，心肌纖維化程度重要指標羥脯氨酸含量明顯增加，與文獻的報道相一致［8，12］，證實了異丙腎上腺素能造成明顯的心肌損傷和纖維化。正常心肌細胞外基質中的膠原主要為I型及Ⅲ型。異常增多且比例失調的膠原纖維使心室壁的順應性下降，如果心肌纖維化進一步加重，勢必損害心肌的收縮功能［1］。連續注射異丙腎上腺素后，心肌組織I、Ⅲ型膠原蛋白表達明顯增高。以上實驗結果顯示該注射方案成功復制了修復性心肌纖維化。而二苯乙烯苷干預組可有效減輕心肌纖維化損傷，降低心肌羥脯氨酸含量及I、Ⅲ型膠原蛋白表達。二苯乙烯苷高劑量組改善的更為明顯。

TGF-β1是導致心肌纖維化諸多因素最后的共同中介之一，在心肌中對于細胞增殖、分化、遷移和細胞外基質的沉積均有重要的作用。一方面，TGF-β1可刺激心肌成纖維細胞大量增生及分化，促進細胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達；另一方面，TGF-β1可以誘導心肌成纖維細胞表型轉變，心肌成纖維細胞轉變成肌成纖維細胞，進一步促進以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的間質蛋白質的合成；同時TGF-β1能抑制蛋白分解酶，最終加速細胞外基質的沉積并導致心肌纖維化發生［13］。Western blot和心肌組織免疫熒光檢測顯示，與模型組相比二苯乙烯苷能明顯下調TGF-β1蛋白表達。結合體外細胞實驗表明，TSG能抑制TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成［14］，推測二苯乙烯苷對修復性心肌纖維化抑制作用可能與調節TGF-β1蛋白表達有關。

心肌纖維化的發展與大量氧自由基生成及脂質過氧化反應密切相關［15］。正常情況下，細胞所具有的抗氧化機制可清除活性氧（reactive oxygen spe-cies，ROS），維持細胞氧化還原自穩態。當某些因素作用于細胞使這一穩態失調，活性氧產生的速率大于清除的速率時，就會造成ROS的蓄積。ROS扮演著類似第二信使的角色，通過激活包括蛋白激酶在內的多種下游受控子，刺激許多轉錄因子和信號級聯，包括活化TGF-β1信號通路，促進膠原的合成［16］。二苯乙烯苷屬多酚類化合物，具有強大的抗氧化作用［5］。在本實驗中，我們發現心肌纖維化小鼠心肌組織中的抗氧化酶SOD和GSH-Px活性明顯降低，中、高劑量的二苯乙烯苷可以明顯增強SOD 和GSH-Px的酶活性。因此結合氧化應激與心肌纖維化關系密切的理論基礎，我們推測二苯乙烯苷的抗氧化作用為其抗心肌纖維化作用的機制之一。

綜上所述，氧化應激和TGF-β1過度表達參與修復性心肌纖維化的過程，二苯乙烯苷對異丙腎上腺素引起的心肌纖維化具有良好的改善作用，其可能的作用機制包括抗氧化和抑制TGF-β1表達等。

（致謝：本實驗在南通大學藥學院藥理學教研室和江蘇省炎癥與分子藥靶重點實驗室完成。）

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2，3，4′，5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside inhibits isoproterenol-induced myocardial fibrosis in mice and its possible mechanisms

ZENG Yi1，WANG Fei2，XU Xiao-le1
（1．Dept of Pharmacology，Pharmacy College，Nantong University；Key Laboratory of Inflammation and Molecular Drug Target，Nantong Jiangsu 226001，China；2．Dept of Cardiothoracic Surgery，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong Jiangsu 226001，China）

Abstract：Aim To study the effects of 2，3，4’，5-tet-rahydroxystilbene-2-O-β-D glucoside（TSG）on myo-cardial fibrosis（MF）induced by isoproterenol（ISO）in mice and its possible mechanism．Methods MF in mice was induced by subcutaneous injection of isoprot-erenol for 14 days．TSG（30，60，120 mg·kg－1）and captopril（40 mg·kg－1）were then administered by gavage to mice．The experiment was stopped 12 h after the last administration of the drugs．Hematoxylin-eosin （HE）and Masson staining were used to estimate the extent of MF．Level of hydroxyproline in myocardial tissues was measured．Protein expressions of collagenⅠ，collagenⅢand transforming growth factor-β1 （TGF-β1）in myocardial tissues were measured．Lev-els of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）were determined．Results Compared with control mice，the level of hydroxypro-line in myocardial tissues was significantly increased in isoproterenol treated mice．Histological sections of iso-proterenol-treated hearts showed extensive myocardial fibrosis．And protein expressions of collagenⅠand col-lagenⅢwere markedly increased in isoproterenol trea-ted mice．However，therapy with TSG decreased the level of hydroxyproline in myocardial tissues，ameliora-ted the degree of myocardial fibrosis，and reduced the collagen expressions induced by isoproterenol adminis-tration．Moreover，treatment with TSG decreased TGF-β1 protein expression and elevated the myocardial SOD and GSH-Px activity．Conclusion TSG can inhibit MF formation induced by ISO in mice which might be due to regulating TGF-β1 protein expression and its an-tioxidant effect．

Key words：2，3，4’，5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D glucoside；isoproterenol；myocardial fibrosis；colla-gen；transforming growth factor-β1；oxidative stress

作者簡介：曾 翼（1980－），男，碩士，助理實驗師，研究方向：心血管藥理學，Tel：0513-85051726，E-mail：zengyi1980＠ntu．edu．cn；許曉樂（1980－），女，博士，副教授，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，Tel：0513-85051726，Fax：0513-85051858，E-mail：xiaolexu＠ntu．edu．cn

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助項目（No 81200079）；南通大學自然科學項目（No 14Z021）；南通大學研究生科技創新計劃資助項目（YKC13065）；江蘇高校優勢學科建設工程項目

收稿日期：2015－06－18，修回日期：2015－08－02

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1388－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．013