野外保存對益智葉片基因組DNA的影響

高炳淼， 王 朝， 何 萍， 田建平， 張俊清， 魏 娜

(海南醫學院 海南省熱帶藥用植物研究開發重點實驗室， 海南 海口571199)

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野外保存對益智葉片基因組DNA的影響

高炳淼， 王 朝， 何 萍， 田建平， 張俊清， 魏 娜*

(海南醫學院 海南省熱帶藥用植物研究開發重點實驗室， 海南 海口571199)

為獲得高質量的益智基因組DNA尋找一種簡單可行的野外益智鮮葉保存方法,利用植物基因組提取試劑盒法提取益智基因組DNA，以新鮮葉片為對照及DNA的純度、濃度、瓊脂糖凝膠電泳和ITS-PCR擴增效果為評價指標，比較室溫陰干、室外曬干、硅膠干燥和液氮保存4種鮮葉保存方法對提取益智基因組DNA效果的影響。結果表明：4種保存方法均可獲得益智基因組DNA且ITS-PCR均獲得約700 bp的PCR產物，其中液氮保存5 d的葉片提取DNA條帶清晰明亮，室溫陰干、硅膠干燥和室外曬干保存方法提取的基因組DNA分別在4 d、3 d和2 d后開始發生降解，不同保存方法效果依次是液氮保存>室溫陰干>硅膠保存>室外曬干。在遠距離野外資源調查和收集時，采用室溫陰干保存新鮮益智葉片是經濟簡單可行的野外保存方法。

益智； DNA提取； PCR； 野外保存方法

益智(AlpiniaoxyphyllaMiquel)為姜科山姜屬植物，其干燥成熟果實為常用中藥。益智仁為海南道地藥材之一，也是我國四大南藥之一，具暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾之功效[1]。益智原產熱帶[2]，主要為人工栽培，分布于海南、廣東雷州半島，此外廣西、福建、云南等地亦有栽培。其中，海南益智仁產量占總產量的95%以上[3]。近年來，對野生益智資源濫采亂挖現象嚴重，致使益智野生資源日漸枯竭，已成為瀕危藥用植物[4]。因此，益智野生資源的可持續性利用和保護勢在必行。

當前，基于基因多態性的DNA分子標記技術已在瀕危藥用植物野生資源利用與保護方面得到廣泛應用，并成為科研工作者的研究熱點[5]。已有文獻報道利用不同方法保存麻黃、扁桃和楊樹等一些植物材料，但不同植物種類其保存方法存在差異[6-8]。筆者按照Chase[9]采用硅膠法保存野外采集的益智新鮮葉片，提取益智基因組DNA結果并不理想。但關于益智新鮮葉片的不同保存方法對南藥益智基因組DNA提取的影響尚未見報道。因此，尋找一種野外可行的保存益智葉片而不影響DNA質量的方法，是目前本研究首要解決的問題。筆者通過對室溫陰干、室外曬干、硅膠和液氮保存4種野外可行的鮮葉保存方法保存的益智葉片樣品進行基因組DNA提取，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法對其完整性、純度以及濃度進行鑒定，再對其ITS-PCR擴增產物進行分析，旨在確定新鮮益智葉片的最佳保存方法，為提取出高質量的基因組DNA奠定基礎，為進一步的分子生物學試驗提供可靠保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物 以益智的新鮮葉片為材料，采自野外移栽于海南醫學院校園的益智新鮮葉片。標本憑證由海南醫學院田建平副教授鑒定為姜科植物益智。

1.1.2 試劑 PCR TaqMix、DL2000、RNaseA、植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)為天根產品均購于海南雋譽科技有限公司，β-巰基乙醇、西班牙瓊脂糖(Biowest Agarose)均購于海南合輝實業有限公司，Goldview核酸染料購于賽百盛公司，其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器 臺式高速冷凍離心機(TGL16M)、恒溫水浴鍋(HH-S24)、凝膠成像系統(Tanon 4100)、核酸蛋白分析儀(Eppendorf)、電泳儀(DYY-7)、PCR儀(杭州博日TC-96)、渦旋混合儀(WH-3)。

1.2 植物樣品保存

取益智嫩葉分別于室溫陰干、硅膠保存、室外曬干、液氮保存共4種方法保存。其中，15份樣品室溫陰干和硅膠保存時間為5 d，9份樣品室外曬干保存時間為3 d(樣品2 d已完全干燥，故只保存3 d即可)，3份液氮保存時間為5 d，每次取3份樣品保存于-80℃，鮮葉為對照。

1.3 基因組DNA提取

稱取200 mg益智新鮮或不同方法保存的葉片，置滅菌后的研缽中，加液氮迅速研磨后小心移入2 mL離心管中，按照天根植物基因組DNA試劑盒說明書提取。

1.4 DNA的電泳及紫外檢測

取5 μL基因組DNA樣品與1 μL上樣緩沖液混勻后點樣于含Goldview核酸染料的0.8%瓊脂糖凝膠孔中，電泳緩解液為1×TBE溶液，電壓為90 V條件下電泳30 min左右，用凝膠成像系統照相并保存。

取20 μL DNA樣品用無菌ddH2O稀釋50倍，混勻后加入石英比色皿中，用核酸蛋白分析儀測定波長260 nm和280 nm的光吸收值。根據A260/A280的值判斷總DNA純度，并計算質量濃度。DNA質量濃度(μg/mL)=A260×稀釋倍數×50。

1.5 PCR擴增反應

以益智基因組中的核糖體DNA(nrDNA)內轉錄間隔區(ITS)序列為模板，擴增引物采用通用引物ITS1和ITS4，分別為5′-AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3′和5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。具體ITS-PCR反應體系和反應條件參照文獻[10]。

2 結果與分析

2.1 不同保存方法的基因組DNA純度及濃度

由表可知，鮮葉和液氮保存提取的基因組DNA的A260/A280值分別為1.80和1.87，說明基因組DNA中的蛋白質和RNA等雜質較少，基因組DNA較純凈，基本無蛋白質、多糖或RNA的污染。液氮保存后提取的基因組DNA與鮮葉提取獲得率基本相當。室外曬干和硅膠保存樣品提取基因組DNA的A260/A280值均小于1.7，且隨保存時間延長其A260/A280值和提取濃度不斷降低，說明硅膠保存和室外曬干保存的樣品提取的基因組DNA中蛋白或酚類雜質污染不易除去。室溫陰干的葉片4 d內提取基因組DNA的A260/A280值為1.8～2.0，存在少量雜質如RNA未除凈，說明在4 d內室溫陰干保存新鮮益智葉片效果較好。

表 不同保存方法益智基因組DNA的純度與得率

2.2 不同保存方法的瓊脂糖電泳比較

由圖1瓊脂糖電泳可知，不同保存方法的南藥益智葉片樣品的基因組DNA提取效果存在明顯差異。

1) 新鮮益智葉片提取的益智基因組DNA條帶整齊、明亮且無拖尾現象，說明新鮮樣品是提取基因組DNA的最理想材料(圖1A)。

2) 新鮮益智葉片硅膠保存5 d后的樣品提取基因組DNA如圖1B顯示，在保存的2 d前提取基因組DNA條帶整齊，主條帶下略有彌散帶；當保存至第3天后，提取基因組DNA條帶彌散程度隨保存時間越來越嚴重，提取的量少且質量不佳，表明基因組DNA已部分發生降解。表明，硅膠保存超過3 d后新鮮益智葉片基因組DNA降解，影響提取質量。

3) 新鮮益智葉片放置于室溫陰干保存5 d后的樣品提取基因組DNA如圖1C顯示，在陰干保存3 d前提取基因組DNA樣品的條帶清晰、明亮整齊略帶拖尾現象；保存第4天后提取基因組DNA條帶明亮度明顯下降，僅提取量較少，但基因組仍然比較完整。表明，室溫陰干保存3 d內可獲得產率較好的完整基因組DNA，5 d內仍然可獲得完整的基因組DNA。

4) 新鮮益智葉片直接放于陽光充足的地方室外曬干保存，當曬到第3天已完全干燥。曬干樣品提取基因組DNA如圖1D顯示，曬干第1天提取的基因組DNA樣品條帶清晰、整齊無拖尾現象，但獲得率較低；曬干第2天后，提取的基因組DNA樣品條帶出現拖尾現象，說明基因組DNA開始發生降解。表明，室外曬干2 d后基因組DNA開始發生降解，得率較少。

5) 新鮮益智葉片迅速置于液氮保存5 d后樣品提取基因組DNA如圖1E顯示，基因組DNA降解較少，提取效果好。保存時間不會影響其基因組DNA的提取效果。表明，液氮保存新鮮益智葉片能提取出高質量的基因組DNA且無降解。

2.3 ITS-PCR分析不同保存方法提取的基因組DNA

植物的ITS具有保守性強，總長度只有600～700 bp，采用通用ITS引物擴增的PCR條帶應在700 bp左右。不同保存方法提取的基因組DNA進行ITS-PCR擴增結果表明，擴增的條帶大小與預期大小相符合(圖2)。從4種方法保存的益智葉片中提取的DNA均可擴增出條帶，其中新鮮葉片、液氮和室溫陰干保存的擴增條帶清晰、明亮而無彌散現象。硅膠保存第4天和室外曬干第2天樣品提取的基因組DNA擴增條帶亮度相對較弱。表明，液氮和室溫陰干保存優于硅膠和室溫曬干2種保存方法，硅膠保存和室外曬干保存不宜作為長距離野外保存新鮮樣品的方法。

注： A 新鮮葉片：Lane M為D 2 000 DNA marker，泳道1～10為新鮮益智葉片。B 硅膠保存：泳道1～2為硅膠保存益智葉片1 d，泳道3～4為硅膠保存益智葉片2 d，泳道5～6為硅膠保存益智葉片3 d，泳道7～8為硅膠保存益智葉片4 d，泳道9～10為硅膠保存益智葉片5 d。C 室溫陰干：泳道1～2為室溫陰干保存益智葉片1 d，泳道3～4為室溫陰干保存益智葉片2 d，泳道5～6為室溫陰干保存益智葉片3 d，泳道7～8為室溫陰干保存益智葉片4 d，泳道9～10為室溫陰干保存益智葉片5 d。D 室外曬干：泳道1～2為曬干保存益智葉片1 d，泳道3～4為室外曬干保存益智葉片2 d，泳道5～6為室外曬干保存益智葉片3 d。E 液氮保存：泳道1～6為保存益智葉片5 d。

Note:A, fresh leaves: Lane M，D2 000 DNA marker; lane 1～10，fresh leaves. B, silica gel: lane 1～2， leaves with silica gel 1 d; lane 3～4， leaves with silica gel 2 d; lane 5～6，leaves with silica gel 3 d; lane 7～8，leaves with silica gel 4 d; lane 9～10，leaves with silica gel 5 d. C, room temperature: lane 1～2，leaves with room temperature 1 d; lane 3～4，leaves with room temperature 2 d; lane 5～6，leaves with with room temperature 3 d; lane 7～8，leaves with room temperature 4 d; lane 9～10，leaves with room temperature 5 d. D, outdoor season: lane 1～2，leaves with outdoor season 1 d; lane 3～4，leaves with outdoor season 2 d; lane 5～6，leaves with outdoor season 3 d. E, liquid nitrogen: lane 1～6，leaves with liquid nitrogen 5 d.

圖1 不同保存方法葉片提取的基因組DNA電泳圖譜

Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA from leaves saved by different preservation methods

注：M為D2000 DNA marker，泳道1為陰性對照，泳道2為新鮮葉片DNA為模板，泳道 3為液氮保存葉片DNA為模板，泳道4～8為硅膠保存葉片DNA為模板，泳道9～13為室溫陰干葉片DNA為模板，泳道14～16為室溫曬干葉片DNA為模板。

Note: lane M，D2000 DNA marker; Lane 1，negative control；lane 2， DNA of the fresh leaves as a template；lane 3，DNA of leaves stored in liquid nitrogen as a template；lane 4～8，DNA of leaves saved in silica as a template；lane 9～13，DNA of leaves dried in room temperature as a template；lane 14～16，DNA of leaves dried at outdoor season as a template.

圖2 ITS-PCR擴增不同保存方法提取的DNA電泳圖譜

Fig.2 Electrophoresis of the ITS-PCR product for different preservation methods

3 結論與討論

研究結果表明，4種保存方法均可獲得益智基因組DNA且ITS-PCR均獲得約700 bp的PCR產物，其中液氮保存5 d的葉片提取DNA條帶清晰明亮，室溫陰干、硅膠干燥和室外曬干保存方法提取的基因組DNA分別在4 d、3 d和2 d后開始發生降解，不同保存方法效果依次是液氮保存>室溫陰干>硅膠保存>室外曬干。

藥用植物基因組DNA提取是中藥分子生物學研究的基本手段，是中藥材分子標記、中藥活性成分關鍵酶基因克隆等后續操作的基礎。提取藥用植物材料基因組的最佳材料是新鮮植物葉片，而干燥后中藥材的基因組DNA已發生嚴重降解，要求質量較高的分子生物學研究無法滿足后續的試驗。植物基因組中DNA的提取方法有多種，如CTAB法[11]、SDS法[12]、高鹽低pH法[13]等。不同提取方法對不同植物提取基因組DNA各有優點，當前植物基因組提取試劑盒法已廣泛應用，且提取質量和穩定性好[14]。為保證提取方法不影響不同保存方法的樣品DNA，本試驗采用植物基因組DNA試劑盒法提取益智葉片基因組DNA。

多數藥用植物，特別是野生及頻危的藥用植物都分布在偏遠的山區，采集這些樣品后若保存方法不當，新鮮材料在旅途中可能枯萎、腐爛，特別是一些離體材料極易受DNA酶的作用，從而導致DNA降解，而無法獲得高質量的DNA[15]。通常情況下，植物材料在低溫環境下可長期存放，如液氮保存下可以抑制相關酶的活性，使DNA降解速度減慢。因此，常采用液氮保存新鮮植物樣品材料，以保持其材料的新鮮度。本研究液氮保存后益智基因組DNA提取結果與文獻報道的研究結果相類似，液氮是保存新鮮葉片的理想方法[7]。但在較遠山區或者時間較長的采樣時，若攜帶液氮凍存植物材料存在液氮易揮發、體積大和成本高等導致諸多不便。已有研究表明，用硅膠干燥和室溫陰干的葉子可以用于基因組DNA的提取[6-8]。從益智新鮮葉片中提取基因組DNA技術已比較成熟，但對于姜科植物益智從硅膠和室溫陰干等保存葉片中提取DNA還未曾有報道。本研究對比了硅膠保存、室外曬干和室溫陰干3種野外可行的保存野外新鮮益智葉片，結果表明室溫陰干效果優于其他2種，與文獻報道的硅膠保存能有效保存基因組DNA的結果不同[9]。原因可能是由于植物材料的不同，南藥益智為多年生草本植物，其地上莖葉纖維質含量高，可以有效地防止組織或細胞失水，延長了其脫離母體后的保鮮時間，減緩了DNA的降解速度。室溫陰干的新鮮葉片置于開放的空氣中，而保存于硅膠密封袋內反而使細胞處于缺氧狀態，加速了細胞凋亡導致基因組DNA更易發生降解[16]。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Effects of Wild Preserved Methods on Genomic DNA fromAlpiniaoxyphyllaLeaves

GAO Bingmiao, WANG Chao, HE Ping, TIAN Jianping, ZHANG Junqing, WEI Na*

(HainanMedicalUniversity,HainanProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentofTropicalMedicinalPlants,Haikou,Hainan571199,China)

In order to find a simple and practical method to save the wildA.oxyphyllafresh leaves, so as to obtain high quality genomic DNA,A.oxyphyllagenomic DNA was extracted using the plant genome Extraction Kit.Compared with fresh leaves, four different preserved methods (dried at room temperature, outdoor season, dried with silica gel, stored in liquid nitrogen) forA.oxyphyllaleaves were evaluated. The effects of which were compared based on the yield, purity, agarose gel electrophoresis and ITS-PCR amplification effect, to identify genomic DNA of leaves which were saved after different methods. Results:Four kinds of preservation methods can getA.oxyphyllagenomic DNA and ITS-PCR were obtained approximately 700 bp PCR product. Genomic DNA was extracted from leaves stored in liquid nitrogen five days, of which bands showed clear and bright, Genomic DNA was extracted from leaves stored in dried at room temperature, silica gel drying and outdoor season, which respectively start degraded after 4 d, 3 d and 2 d. The effect of different preservation methods are stored in liquid nitrogen > dried at room temperature > dried with silica gel > outdoor season.Therefore, freshA.oxyphyllaleaves stored at room temperature drying is both economical and feasible method of field preservation in the distant field resources investigation.

Alpiniaoxyphylla; DNA extraction; PCR； wild preserved methods

2014-01-29； 2015-05-11修回

海南省自然科學基金項目“益智遺傳多樣性的AFLP分析”(814291)；海南醫學院藥學院大學生創新課題“益智AFLP-PCR體系的建立與優化”(Hyydc2013004)；海南醫學院引進人才科研啟動經費

高炳淼(1982-)，男，講師，博士，從事南藥資源開發與生物技術工作。E-mail:gaobingmiao@qq.com

*通訊作者：魏 娜(1980-)，女，副教授，從事南藥黎藥的藥效物質基礎工作。E-mail:weina-0613@163.com

1001-3601(2015)07-0351-0019-04

S567.7+9

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