五倍子降低大腸桿菌耐藥性的效果

韋 嬪， 譚艾娟， 黃弘宇， 呂世明， 王學君， 符東順， 蔣慶慶

(1.貴州大學 生命科學學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學 動物科學學院， 貴州 貴陽550025)

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五倍子降低大腸桿菌耐藥性的效果

韋 嬪1， 譚艾娟1， 黃弘宇1， 呂世明2*， 王學君1， 符東順1， 蔣慶慶1

(1.貴州大學 生命科學學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學 動物科學學院， 貴州 貴陽550025)

為探明五倍子對大腸桿菌耐藥質粒的消除效果和恢復對抗菌藥物的敏感性，研究五倍子提取物處理耐藥大腸桿菌E11、E22、E33、E44和E55，通過影印培養法篩選出耐藥性消除菌落，應用微量肉湯稀釋法檢測其對抗菌藥物敏感性的變化，同時檢測消除子內質粒的丟失情況。結果表明：經1/2 MIC(最小抑菌濃度)五倍子提取物作用48 h后的耐藥大腸桿菌E11、E22、E33、E44和E55對慶大霉素耐藥性的消除率分別為24.41%、11.67%、10.33%、5.33%和16.67%，遠高于十二烷基硫酸鈉處理對照組(2.87%)；耐藥消除子對多種抗菌藥物的MIC值出現下降，對慶大霉素、卡那霉素、地美環素和頭孢唑林的敏感性除個別菌恢復至中介外，均從耐藥、高度耐藥恢復至敏感，MIC值降低最高達256倍。五倍子能恢復耐藥菌對抗菌藥物的敏感性，但耐藥菌的質粒丟失與細菌耐藥性下降無相關性。

五倍子； 大腸桿菌； 耐藥性； 質粒； 消除

大腸桿菌是人類及動物腸道的正常寄生繁殖菌群，在環境中也廣泛存在，作為條件性致病菌，其具備接受、儲備和傳播耐藥遺傳因子的能力，是潛在的耐藥基因儲存庫或中介站，其質粒常攜帶多種耐藥基因，以不同的方式在菌株間以較高的頻率轉移，是耐藥性傳播的重要方式[1]。近年來，隨抗菌藥物廣泛使用，尤其是不規范使用，導致大腸桿菌的耐藥水平不斷增加，高度耐藥和多重耐藥現象十分嚴重。因此，如何有效消除大腸桿菌耐藥質粒，減少耐藥基因的傳播，對降低或消除細菌耐藥性的危害具有重要意義[2]。為此，筆者用五倍子提取物消除大腸桿菌的耐藥性及耐藥質粒，從而使其恢復對抗菌藥物的敏感性，以減少耐藥基因的傳播，降低或消除細菌耐藥性的危害。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

藥物：五倍子，購于西安海佳生物科技有限公司；慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、環丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、地美環素(DMCT)、四環素(TET)、磺胺嘧啶(SD)、頭孢唑林(CEF)，均購自大連美侖生物技術有限公司。試劑：LB培養基、伊紅美蘭瓊脂、MH瓊脂，均購自上海博微生物科技有限公司；氯化鈉(NaCl，分析純)，購于南匯彭德公社營房化工廠；十二烷基硫酸鈉(SDS，分析純)，購自廣東順德化學生物研究所；質粒DNA抽提試劑盒，購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 菌株

耐藥大腸桿菌E11、E22、E33、E44和E55，分離自貴州省的部分規模養豬場，對卡那霉素、四環素、頭孢唑林、慶大霉素、環丙沙星、氧氟沙星、地美環素和磺胺嘧啶均耐藥。

1.3 五倍子提取液的制備及MIC測定

將中藥五倍子按劉玉慶等[3]的方法煎煮提取后濃縮，使藥液中生藥含量為1 g/mL，115℃滅菌25 min，保存于4℃冰箱備用。參照文獻[3-6]的方法測定五倍子提取液對耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)值。

1.4 耐藥質粒消除子的篩選與鑒定

在LB肉湯培養基中加入五倍子提取液，使肉湯中五倍子的濃度為1/2 MIC，再分別加入耐藥大腸桿菌(菌落數為5×l05CFU/mL)，37℃恒溫培養48 h，同時設不加藥物的空白組和SDS對照組；然后再劃線培養于無藥LB培養基平板上，37℃培養，待長出單個菌落后隨機挑取300個菌落，按照影印培養法[7-8]用無菌牙簽分別挑取菌落對應點種于含GEN的MH瓊脂平板及無藥MH瓊脂平板上，37℃培養24 h，挑取在含慶大霉素平板上不生長而在無藥平板上生長的菌落，在LB固體培養基上傳代后，再次接種在含慶大霉素平板上證實不生長的細菌，即為消除子。根據耐藥性消除菌落數與檢測菌落總數之比，計算大腸桿菌耐藥性的消除率[9]。

1.5 菌株的質粒分析和耐藥表型變化

通過提取5株耐藥大腸桿菌及其相應消除子的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察耐藥性消除后菌株質粒是否丟失。參照CLSI標準，應用微量肉湯稀釋法測定5株大腸桿菌及其消除子對GEN、KAN、CIP、OFL、DMCT、TET、SD和CEF的MIC值，對比分析耐藥性消除前后的耐藥表型變化和藥物敏感性的恢復效果。

2 結果與分析

2.1 五倍子提取液對大腸桿菌的MIC值

經測定，五倍子提取液對大腸桿菌表現出較好的抑菌效果，對大腸桿菌E11、E33和E55的MIC值均為7.81 mg/mL，對大腸桿菌E22和E44的MIC值均為15.62 mg/mL。

2.2 對慶大霉素耐藥性的消除

從表1看出，五倍子對菌株耐藥性表現出一定的消除效果，作用24 h后，對耐藥菌株的最高消除率可達22.33%，平均消除率為12.53%；48 h后最高消除率可達24.41%，平均消除率為13.68%，對大腸桿菌耐藥性的消除率均高于十二烷基硫酸鈉組。未經藥物處理的空白對照的耐藥性自發消除率為0，說明細菌耐藥質粒無法自然丟失。

2.3 耐藥性消除前后菌株的質粒

大腸桿菌經五倍子提取液作用48 h后，除E11和E55菌株質粒條帶沒有丟失外，E22和E33均丟失了2條質粒條帶，E44丟失1或3條質粒條帶(圖示)，說明中藥五倍子有消除大腸桿菌耐藥質粒的效果。

表1 五倍子提取物處理后5株大腸桿菌對慶大霉素耐藥性的消除率

Table 1 Elimination rate of 5E.colistrains treated with Galla Chinensis extract to Gentamicin resistance

組別Groups時間/hTime菌株消除率/%EliminationrateofstrainsE11E22E33E44E55平均五倍子2422.3311.679.333.6715.6712.53 GallaChinensis4824.4111.6710.335.3316.6713.68十二烷基硫酸鈉SDS241.674.670.6723.672.54 Sodiumdodecylsulfate48250.672.6742.87空白對照CK2400000048000000

注：M為5 000 DNA Mark，1為E11，2為E22，3為E33，4和5為E11消除子，6為E22消除子，7為E33消除子，8～10為E44消除子，11為E55消除子，12為E44，13為E55。

Note: M, 5000DNA Marker; 1, E11; 2, E22; 3, E33; 4 and 5, Drug resistant colony of E11; 6,Drug resistant colony of E22; 7, Drug resistant colony of E33; 8～10, Drug resistant colonies of E44; 11, Drug resistant colony of E55; 12, E44; 13, E55.

圖示 耐藥大腸桿菌質粒消除前后的圖譜

注：S表示敏感，I表示中介，R表示耐藥。

Note: S, Susceptibility; I, Intermediary; R, Resistance.

2.4 耐藥性消除前后細菌的耐藥表型

從表2看出，未經五倍子提取液作用前，5株大腸桿菌對8種抗菌藥物均耐藥，經五倍子消除處理后，除對磺胺嘧啶的MIC值變化較小外，其余藥物的MIC值均下降，其中，對卡那霉素、慶大霉素從高度耐藥均恢復敏感，對頭孢唑啉除E22變為中介外其余4株均由高度耐藥恢復至敏感，對地美環素除E44變為中介外均由耐藥恢復至敏感。

3 結論與討論

3.1 五倍子抑制大腸桿菌的效果

中藥是純天然物質，具有來源廣泛、安全可靠、毒副作用小、不易產生耐藥性等特點，在中國應用于動物和人類已有幾千年的歷史[10]，有些中藥成分具有抑菌作用，可以消除細菌的耐藥質粒[11]。五倍子作為傳統中藥，有斂肺澀腸功效，對大腸桿菌的抑制效果較好。研究結果表明，五倍子提取液對大腸桿菌具有一定的抑制作用，與馬馳[12]的研究結果一致。五倍子提取液對不同細菌的抑菌濃度不同，原因可能是與不同耐藥菌株的耐藥程度和耐藥機制不同有關[13]。

3.2 五倍子對大腸桿菌耐藥性的消除

研究結果表明，空白對照組大腸桿菌的耐藥性消除率為0，表明耐藥大腸桿菌其質粒自然丟失的概率極低，而五倍子對耐藥大腸桿菌的耐藥性具有消除作用，但對不同菌株耐藥性的消除率不同，作用48h后對E11耐藥性的消除率為24.41%，對E44僅為5.33%；且隨著作用時間的延長，其消除率均有所提高，呈現時間依賴性。

3.3 五倍子可致大腸桿菌質粒丟失

測定結果表明，五倍子提取液可使細菌丟失質粒條帶，質粒條帶丟失的消除子對抗菌藥物的耐藥性明顯降低，與馬馳[12]、舒剛等[14]的研究結果一致。但五倍子引起細菌質粒丟失的難易程度和順序，以及質粒丟失與耐藥譜型變化的關系有待進一步研究。

3.4 五倍子可使耐藥大腸桿菌的敏感性恢復

五倍子提取液作用后耐藥菌對慶大霉素、卡那霉素、地美環素和頭孢唑林的敏感性恢復程度較大，除個別菌外其他從耐藥恢復至敏感，其最小抑菌濃度(MIC)降低最高達256倍，多數藥物的MIC值出現下降。說明，五倍子可在一定程度上恢復耐藥菌對抗菌藥物的敏感性，但五倍子使耐藥菌的質粒丟失與細菌耐藥性下降未呈相關性，有些消除子雖然其質粒條帶沒有丟失，但其耐藥性也明顯降低，其原因可能是部分決定耐藥基因的小分子轉座子或插入序列被消除，由于堿基數量少，因此在質粒的凝膠電泳圖譜上沒有區別[15]；也有可能是因為中藥作用機理還不明確，作用后質粒條帶雖未丟失，但致使菌株攜帶的耐藥基因發生突變而不表達[16]。

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(責任編輯： 馮 衛)

Effects of Galla Chinensis on Drug Resistance ofEscherichiacoli

WEI Pin1, TAN Aijuan1, HUANG Hongyu1, LV Shiming2*,WANG Xuejun1, FU Dongshun1, JIANG Qingqing1

(1.CollegeofLifeScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025; 2.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The elimination drug resistance colonies were screened from 5E.colistrains (E11,E22,E33,E44and E55)treated with Galla Chinensis extract by replica plating method. The antibiotic susceptibility and plasmid loss of elimination drug resistance colonies were detected by micro-broth dilution method to explore the elimination effects of Galla Chinensis on drug resistant plasmid and restoring antibiotic susceptibility ofE.colii strains.Results:The elimination rate of E11, E22, E33, E44 and E55E.colistrains with drug resistance treated with 1/2 MIC ( minimum inhibition concentration) Galla Chinensis extract after 48 h to Gentamicin resistance is 24.41%, 11.67%, 10.33%, 5.33% and 16.67% respectively, significantly higher than Sodium dodecyl sulfate treatment (2.87%).MIC value of drug resistant elimination colonies against multiple antibacterial agents reduces and the susceptibility of drug resistant elimination colonies against Gentamycin, Kanamycin, Demeclocycline and Cefazolin recovers from drug resistance and high drug resistance except for individual colonies. MIC value of drug resistant elimination colonies can decrease by 256 times compared with original drug resistant elimination colonies. Galla Chinensis can recover the susceptibility of drug resistant bacteria against antibacterial agents but plasmid loss of drug resistant bacteria is not related to reduction of drug resistance of bacteria.

Galla Chinensis;Escherichiacoli; drug resistance; plasmid; elimination

2015-03-25； 2015-07-09修回

貴州省科技廳社會發展攻關計劃項目“豬肉食品安全保障關鍵技術研究”[黔科合SY字(2012)3060]；貴州大學研究生創新基金項目“中藥消除大腸桿菌耐藥質粒的研究”(研農2015013)

韋 嬪(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：細胞功能成分研究與利用。E-mail:425702628@qq.com

*通迅作者：呂世明(1963-)，男，教授，博士，從事獸醫藥理學及毒理學研究。E-mail:lvlvsm@163.com

1001-3601(2015)07-0381-0137-03

S858.28

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