菊花嵌合體‘su-07’花色性狀的組培分離及變異分析

孔周陽， 閆俊芳， 張萍萍， 陳 馳， 牛瑞鶴， 祁 偉， 談建中

(蘇州大學建筑與城市環境學院，蘇州市建筑與城市環境重點實驗室，江蘇蘇州 215123)

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菊花嵌合體‘su-07’花色性狀的組培分離及變異分析

孔周陽， 閆俊芳， 張萍萍， 陳 馳， 牛瑞鶴， 祁 偉， 談建中*

(蘇州大學建筑與城市環境學院，蘇州市建筑與城市環境重點實驗室，江蘇蘇州 215123)

[目的]分離和固定菊花嵌合花色性狀，并探討其花色變異機制。[方法]以紫紅-黃色相嵌的菊花花色嵌合體‘su-07’為材料，通過花瓣組織培養再生植株的花色表型，分析花色嵌合體性狀的穩定性和分離狀況；同時，采用徒手切片的方法，檢測不同花色花瓣的細胞內色素分布狀況。[結果]在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養基上，不同花色的花瓣均可誘導形成愈傷組織，進而分化形成不定芽，經繼代培養、生根培養及大田栽培，成功獲得了性狀穩定遺傳的黃色株系；在紫紅色花瓣和嵌合花瓣的表皮細胞中都觀察到了黃色花色素的存在。[結論]分離的黃色性狀來源于嵌合體花瓣的表皮細胞，而未能獲得紫紅色性狀的再生植株也與此有關。

黃色色素；菊花; 花色嵌合體; 花瓣; 花色變異; 組織培養

菊花(Chrysanthemummorifolium)為菊科多年生宿根草本植物，是世界著名的切花品種之一，也是我國十大名花之一[1-2]。菊花屬于天然異花授粉植物，在自然界常常由于種間自然雜交等因素的影響而造成不同類型的花色變異，而一旦發現優良變異，采用無性繁殖的方式及時將變異的性狀分離和固定下來，即可以使之成為新的品種或品系，其中組織培養技術已得到廣泛應用[3]。

植物嵌合體是指含有2種或者2種以上遺傳型的植物組織或植物個體[4]，主要由植物頂端細胞系中存在遺傳基礎不同的細胞而形成[5]，當嵌合表現在花朵上時，便形成了花色嵌合體，這在增加觀賞植物品種的多樣性、提供稀有異色花新品種方面具有特殊的應用價值[6-8]。在菊花方面，也有若干花色嵌合體的研究報道[9-11]。該研究供試材料菊花嵌合體‘su-07’表現為花色嵌合, 在不同側枝或花朵上具有多種形態的雙色(紫紅-黃色)表型，具有特殊的觀賞價值。為了解該嵌合體的遺傳特性、分離和固定其嵌合花色性狀，筆者采用花瓣組織培養技術獲得再生植株，探討其花色性狀的穩定性及分離情況，以得到花色性狀穩定遺傳的株系，為菊花新品種選育提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料供試材料為菊花花色嵌合體‘su-07’，由蘇州大學建筑與城市環境學院園藝植物生物技術研究室于2007年發現，其花色表現為不同花朵或同一花朵的紫-黃色嵌合性狀，并能通過扦插繁殖得以保存。在秋季選擇生長健壯的盆栽苗花瓣作為組織培養的外植體材料。

1.2 花瓣的離體培養

1.2.1外植體處理。從菊花花色嵌合體上采集2種花瓣作為外植體，一種花瓣正面外觀為純紫紅色(圖1P1)，而背面紫紅色較淡，且有細絲狀黃色條紋相嵌(圖1P2)，另一種正、背面均顯嵌合花色(圖2C1、C2)。將選取的花瓣經流水清洗后，用濾紙將多余的水分吸干。超凈工作臺上用75%乙醇處理3～5 s，0.1%的升汞溶液滅菌5 min，用無菌水充分清洗后用于接種。

1.2.2花瓣培養。已滅菌的花瓣用刀片剪去花托，再剪成長5～10 mm的小塊，接種在 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養基中，花瓣下表面接觸培養基。光照培養箱中培養，溫度25 ℃，光照12 h/d，光照強度2 000 lx左右。

1.2.3生根培養與移栽。當花瓣愈傷組織分化形成的不定芽長至2～3 cm后，轉接到生根培養基1/2MS+NAA0.1 mg/L中，誘導生根。當組培苗生根至2～3 cm時，煉苗2～3 d，清洗附著在幼苗上的培養基，溫室中放置7 d左右，移栽到苗圃中統一管理，統計組培苗花色性狀的變異情況。

1.3 花瓣橫切面的解剖觀察取花色嵌合體不同花色的新鮮花瓣，在花瓣中部切取長約10 mm的部分，利用徒手切片法得到花瓣的橫切面切片，直接于顯微鏡下進行觀察。

2 結果與分析

2.1 菊花花色嵌合體‘su-07’的花色表型供試菊花花色嵌合體‘su-07’的花色表型為紫紅色-黃色鑲嵌，其中可分為2種類型：同一植株不同枝條花朵間的花色嵌合，同一朵花不同花瓣間的花色嵌合，顯示多種不同花色的形態變化。如同一朵花不同花瓣間的嵌合體中(圖2)，其花瓣顏色分別表現為純黃色(Y)、黃色為主(C1)、黃色和紫紅色各半(C2)、紫紅色為主(C3)、紫紅色(P)等多種類型。

2.2 菊花嵌合花色性狀的組培分離與固定將滅菌好的花瓣外植體接種到培養基中約7 d后，花瓣基部均變為綠色，并開始形成愈傷組織(圖2A)；20 d后，除少數花瓣由黃變褐、逐漸枯死外，大部分花瓣基部膨大2～3倍，先后形成愈傷組織，并能觀察到瘤狀突起的不定芽(圖2B)；不定芽形成后，經過60 d的繼代培養，大部分菊花組培苗可長至2～3 cm (圖3C)。將試管苗接種到1/2MS+NAA 0.1 mg/L生根培養基上，經過20 d左右的培養，單株組培苗生根數可達6～15條，根長3～6 cm；移栽大田后用于花色性狀的調查分析。 從菊花花色嵌合體的不同植株上采集紫紅色花瓣和嵌合花色花瓣作為外植體進行組織培養，結果獲得了28個再生植株，并于翌年秋季開花。根據組培苗的花色表型調查結

果，2種花瓣的再生組培苗的花色表型均為純黃色花瓣，并經扦插繁殖可以穩定遺傳；雖然分離、固定了花色單一的黃色株系，但未能獲得紫紅色表型的再生植株。為進一步探討其成因，采用徒手切片方法對不同嵌合花色的花瓣進行解剖觀察。

圖4 菊花花色嵌合體花色素在花瓣組織中的分布2.3 菊花嵌合體不同花色花瓣的解剖觀察選取純黃色花瓣(Y)、嵌合花瓣(C)、紫紅色花瓣(P)為材料進行徒手切片，從圖3可以看出，在黃色花瓣中僅觀察到黃色花色素的存在，而在紫紅色花瓣和嵌合花瓣中，除紫紅色的花色素外，在其上下表皮細胞中都有黃色色素存在。推測在花瓣培養過程中，表層細胞由于最先接觸到培養基且分化形成愈傷組織，其再生植株都將表現為純黃色性狀。

3 討論

植物嵌合體主要是由于頂端細胞系中存在遺傳基礎不同的細胞而形成的，當嵌合表現在花朵上時，便形成了花色嵌合體。前人對嵌合體的研究主要集中在2個方面：一是分離嵌合體中的有利變異，用于培育新的品種；另一類是利用人工合成或天然的周緣嵌合體來培育新品種，并研究不同層內細胞與組織發育的相關性及細胞層間的互作。

觀賞植物嵌合體中新的遺傳類型可能具有更優良的性狀，從而成為品種培育的分離純化目標，而在嵌合性狀的分離方面，組織培養是其中最為有效的方法。呂秀立等[8]采用組織培養的方法實現了矮牽牛嵌合性狀的固定，說明通過組織培養技術可以實現嵌合性狀的分離固定，且再生植株能穩定遺傳。傳統雙色菊花品種“金背大紅”的花瓣上表皮為紅色、下表皮為黃色，取顯色的花瓣作為外植體進行組織培養，可使雙色嵌合體品種的花色分離形成3種類型：部分植株保持了母株性狀，部分植株表現為紫紅色，還有一部分分化成花瓣下表皮保持黃色而上表皮為紫黃鑲嵌的嵌合花色；趙若蘭等[9]以花蕾為外植體，通過組織培養技術成功分離了菊花花色嵌合體，嵌合性狀消失。

該研究供試的菊花花色嵌合體‘su-07’在不同枝條上發育形成不同顏色的花瓣，其中包括“同株異花雙色”、“同花嵌合雙色”等多種類型，且是一種可遺傳的花色嵌合體，這些花色變異材料作為特色品種資源具有一定的應用價值。為此，該研究采用花瓣離體組織培養的方法分離、固定其嵌合性狀，結果獲得了遺傳穩定的黃色株系。但從紫紅色花瓣和嵌合花瓣為外植體誘導獲得的再生植株，未能觀察到紫紅色表型的花瓣。筆者認為這與花瓣細胞中不同花色素的分布有關，因為在不同花色花瓣組織的橫切面中，黃色花瓣中表現黃色的色素均勻分布于各層細胞，而在嵌合花瓣和紫紅色花瓣的表層細胞中也觀察到黃色色素的存在；供試的紫紅色花瓣和嵌合花瓣的上表皮雖然表現為紫紅色，但下表皮略微黃色，初代培養時花瓣的下表皮接觸培養基，可能早于紫色色素的細胞分化形成愈傷組織，從而使得再生植株表現為穩定遺傳的純黃色性狀。

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[3] 建德鋒,趙文若,趙海鋒,等. 菊花組織培養技術研究[J].北方園藝, 2007(9):200-201.

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[5] 李明銀,何云曉. 植物遺傳嵌合體及其在觀賞植物育種中的應用[J]. 植物學通報, 2005,22(6):641-647.

[6] POETHIG R S. Clonal analysis of cell lineage patterns in plant development [J]. Am J Bot, 1987, 74:581-594.

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[9] 趙若蘭,張道旭. 利用組培法分離菊花嵌合體研究初探[J].遼寧農業科學,1992(4):56-57.

[10] 栗茂騰,余龍江,王麗梅,等. 菊花花色遺傳及花色嵌合體發現[J].遺傳,2005,27(6):948-952.

[11] 宋威,祝朋芳. 離子注入法誘變菊花及嵌合體分離的研究[J].北方園藝,2010(3):135-138.

Tissue Segregation and Variation Analysis of the Flower Color Characters in the Chimeric Chrysanthemum ‘su-07’

KONG Zhou-yang. YAN Jun-fang, ZHANG Ping-ping, TAN Jian-zhong*et al

(School of Architecture and Urban Environment, Soochow University, Key Laboratory of Architecture and Urban Environment, Suzhou, Jiangsu 215123)

[Objective] The aim was to segregate and stable the chimeric color characters, and to explore the mechanism of color variation in Chrysanthemum. [Method] By using a yellow-purple bi-color chimera as experiment material, named ‘su-07’, the stability and separation condition of color chimera characters were analyzed through studying the color phenotypes of regeneration plant by tissue culture of petals; meanwhile, pigment stribution in cells of different flower petals was detected by using the method of freehand section. [Result] The callus could be induced by different color petals in the culture medium of MS+6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L, and then differentiated to form adventitious bud. The yellow strains of genetic stability were successful obtained through subculture, rooting culture and field cultivation; and the presence of yellow pigments was also observed in epidermal cells of purple petals and chimeric petals. [Conclusion] The plantlet with yellow color characters were differentiated from epidermal cells in chimeric petals, and that of purple character which failed to obtain was also related to it.

Yellow pigment; Chrysanthemum; Color chimera; Petal; Color variation; Tissue culture

蘇州市應用基礎研究計劃項目 (SYN201205)。

孔周陽(1991- )，女，江蘇東臺人，碩士研究生，研究方向：園林植物資源與應用。*通訊作者，教授，從事園林植物資源與生物技術方面的研究。

2014-11-26

S 682.1+1

A

0517-6611(2015)02-014-02