鎘脅迫對4種草坪草抗逆生理特性的影響

陳 偉，張苗苗，宋陽陽，張德罡

（1.甘肅農業大學 草業學院／草業生態系統教育部重點實驗室／甘肅省草業工程實驗室／中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州城市學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學 林學院，甘肅 蘭州 730070）

隨著工業化進程的不斷加快，環境污染成為日益突出的生態問題之一。重金屬在土壤中的不斷積累與富集也對環境造成嚴重危害。Cd是毒性很強的一種重金屬，也是農田受污染最普遍的重金屬之一，被聯合國環境規劃局和國際勞動衛生重金屬委員會認定為重點環境污染物，被美國毒物管理委員會列為第6位危害人體健康的有毒物質［1］。Cd在自然界中主要來自巖石和礦物中的本底值，巖石圈中Cd的含量在0.1～0.2 mg／kg［2］，不會對人體及生態系統構成危害。但是隨著采礦、冶煉和電鍍工業的不斷發展，大量含Cd廢水排入河流。同時，某些磷肥含有大量的Cd，在使用過程中會造成Cd在土壤中的累積。另外，由于Cd在生物體內遷移性比較強，在人體中累積達到一定程度，會造成慢性中毒［3－5］。

重金屬對植物產生脅迫后，植物會發生一系列生理生化反應來抵御這種逆境。以4種草坪草種為對象，通過盆栽試驗研究了Cd2＋對草坪草脯氨酸含量、MDA含量和抗氧化酶活性等抗逆生理特性的影響，探討草坪草對Ca2＋耐受能力，為研究草坪草抗重金屬脅迫機制和篩選抗性草種提供數據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試草種：草地早熟禾 （Poa pratensis）品種百斯特（Barrister），多年生黑麥草（Lolium perenne）品種首相（Premier），高羊茅（Festuca elata）品種銳步（Barrera），白三葉（Trifolium repens）品種海發（Haifa），由百綠公司提供。供試金屬離子：3CdSO4·8H2O分析純試劑。

1.2 重金屬離子處理梯度設置

重金屬離子以溶液形式加入到培養皿中，重金屬離子濃度依據中華人民共和國國家土壤環境質量標準（GB15618－2008）3級土壤環境標準量進行配制［6］，結合預試驗結果設置Cd2＋濃度，其濃度梯度依次為Cd2＋（1，50，100，150 mg／kg）。同時設置對照處理。

1.3 試驗方法

將供試種子棄去雜質和有蟲蝕及成熟度較低的種子，用0.1%KMn O4溶液浸泡15 min，用自來水沖洗數次，至無紅色為止，再用去離子水沖洗3次，用濾紙將水吸干。直接播入以蛭石為基床、直徑12 cm花盆，發芽方法按GB／T 2930.4－2001，待草坪草幼苗長出2片展開葉時按照1株／cm2的標準剔除多余幼苗，根據培養基70%持水量每天注入Hoagland’s營養液并將重金屬無機鹽溶液按梯度施入，當幼苗長出第4片葉時進行生長發育指標的測定。

1.4 草坪草抗逆生理指標測定

1.4.1 脯氨酸含量測定 采用酸性茚三酮法［7］。

單位鮮重樣品中脯氨酸含量＝（x×5／2）／（樣重×106）×100%

MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，稱取各供試草坪草葉片材料1 g，加入2 m L 10%的三氯乙酸（TCA），研磨，最后用TCA定容10 m L。

MDA（μmol／L）＝6.45×D532nm－0.56×D450nm

酶的提取：取0.1 g葉片與預冷研缽中，加入1 mL酶提取液以50 mmol／L pH 7.8的磷酸緩沖液配制，含有0.1 mmol／L EDTA、質量濃度為0.3%Triton X－100和質量濃度為4%聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），在冰浴上研磨成勻漿，加酶提取液使終體積為5 mL。在冷凍離心機中4℃下，10 000 r／min，離心20 min，取上清液用于酶活力測定。

SOD活性的測定采用氮藍四唑（NBT）法測定，POD活性的測定采用愈創木酚法測定。

1.5 數據統計分析

運用Excel整理數據、制作相關圖表，用SPSS統計軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 Cd2＋脅迫對草坪草脯氨酸含量的影響

Cd2＋脅迫下4種草坪草脯氨酸含量均顯著高于對照（圖1），且隨離子濃度的升高而升高。其中，高羊茅和草地早熟禾脯氨酸含量在不同濃度Cd2＋脅迫下差異顯著（P＜0.05）；多年生黑麥草在Cd2＋濃度為0～100 mg／kg處理時脯氨酸含量差異顯著（P＜0.05），但是在Cd2＋濃度為100 mg／kg和150 mg／kg處理下脯氨酸含量差異不顯著。Cd2＋濃度為0，1和50 mg／kg時，白三葉脯氨酸含量差異顯著，但是，隨著離子濃度的升高，白三葉脯氨酸含量差異不顯著（P＜0.05）。

圖1 Cd2＋脅迫下草坪草脯氨酸含量Fig.1 Effect of Cd2＋ on proline content of turfgrass

2.2 Cd2＋脅迫對草坪草MDA含量的影響

Cd2＋各濃度處理下，4種草坪草 MDA含量隨著離子濃度的升高而不斷增加（圖2），均與對照差異顯著（圖2）。其中，高羊茅和草地早熟禾 MDA含量在Cd2＋各濃度處理之間差異顯著（P＜0.05）；多年生黑麥草在Cd2＋濃度為1 mg／kg，50 mg／kg時其 MDA含量差異不顯著，在100，150 mg／kg時其 MDA含量差異顯著；白三葉 MDA含量在Cd2＋濃度為0，1，50，100 mg／kg時差異顯著，但是100和150 mg／kg處理下其MDA含量差異不顯著（P＜0.05）。

圖2 Cd2＋脅迫下草坪草MDA含量Fig.2 Effect of Cd2＋ on MDA content of turfgrass

2.3 Cd2＋脅迫對草坪草抗氧化酶活性的影響

隨Cd2＋濃度增加，草地早熟禾SOD活性均與對照差異顯著（P＜0.05），且有隨著離子濃度的升高有逐漸升高的趨勢；Cd2＋處理多年生黑麥草、高羊茅和白三葉，低濃度時其SOD活性變化不大，與對照差異不顯著，但隨著Cd2＋離子濃度的升高，SOD活性上升，在Cd2＋濃度為150 mg／kg時，供試草坪草SOD活性達到最大值（表1）。

表1 Cd2＋脅迫下草坪草SOD的活性Table 1 Effect of Cd2＋on SOD activity of 4 turfgrasses

Cd2＋脅迫對草坪草POD活性會產生不同程度的影響（表2）。其中，Cd2＋處理下高羊茅和草地早熟禾POD活性急劇上升，在低濃度處理下顯著高于對照，而且隨著離子濃度的升高而逐漸升高；Cd2＋濃度為1 mg／kg時，多年生黑麥草和白三葉POD活性與對照差異不顯著，稍有升高，當Cd2＋達到50 mg／kg及更高時，2種草坪草POD活性急劇升高，顯著高于對照，且隨著離子濃度的升高而不斷升高。

表2 Cd2＋脅迫下草坪草POD活性Table 2 Effect of Cd2＋on POD activity of 4 turfgrasses

3 討論與結論

脯氨酸是植物蛋白的組成之一，一方面作為細胞內重要的滲透調節物質，起著調節細胞滲透平衡、增強細胞結構穩定性和組織氧自由基產生的重要作用［8］；另一方面由于脯氨酸具有偶極性，其疏水端與蛋白質聯結，而親水端與水分子相結合，從而使蛋白質束縛更多的水，防止在滲透脅迫條件下蛋白質脫水，增強了細胞膜結構的穩定性［9，10］。研究表明，在逆境條件下，植物為了防御傷害，維持正常的生理生化功能，體內必然相應地產生一系列物質代謝變化，游離脯氨酸含量的大量積累就是這些變化之一［8，11］。從試驗結果可以看出，不同濃度Cd2＋處理對4種草坪草都產生了一定程度的脅迫。其中，高羊茅和草地早熟禾脯氨酸含量在不同濃度Cd2＋脅迫下差異顯著，多年生黑麥草在Cd2＋濃度為0，50，100 mg／kg處理時脯氨酸含量差異顯著，但是在Cd2＋濃度為100和150 mg／kg處理下脯氨酸含量差異不顯著，說明Cd2＋脅迫對多年生黑麥草有一定影響，但是當Cd2＋濃度達到較高水平時多年生黑麥草脯氨酸含量差異不顯著；白三葉在Cd2＋濃度為0，1，50 mg／kg脯氨酸含量差異顯著，在50，100，150 mg／kg處理差異不顯著，可能是白三葉對Cd2＋較高濃度脅迫反應不敏感，對Cd2＋有較強耐受性，也可能情況剛好相反，Cd2＋較低濃度處理就已經達到白三葉能夠耐受的最大范圍，從而導致不能正常分泌脯氨酸。

細胞膜是植物細胞的保護組織，各種逆境脅迫對細胞的危害首先作用于細胞膜［12］。重金屬是細胞脂質過氧化的誘導劑，當重金屬處理植物時，細胞內自由基產生和消除之間的平衡受到破壞，導致大量活性氧自由基產生，進而引發膜中不飽和脂肪酸產生過氧化反應，破壞細胞膜結構和功能［13，14］。不飽和脂肪酸所發生的一系列活性氧反應的產物丙二醛（MDA）成為反應細胞膜損傷程度的重要指標［8，15］。在重金屬離子脅迫下，細胞膜受到傷害，胞內離子和有機物大量外滲，外界有毒物質進入細胞，最終導致植物體內一系列生理生化過程失調［13］。大量研究證明，重金屬離子濃度越高，丙二醛累積越多［16－20］。

結果表明，Cd2＋對4種草坪草細胞膜影響較大，草坪草MDA含量隨著離子濃度的升高而不斷增加，且與對照差異顯著；其中，高羊茅和草地早熟禾MDA含量在Cd2＋各濃度處理之間差異顯著；多年生黑麥草在Cd2＋濃度為1，50 mg／kg時其MDA含量差異不顯著，在50，100和150 mg／kg時其 MDA含量差異顯著，說明多年生黑麥草細胞膜對一定濃度的Cd2＋脅迫有相應的耐受性，但是隨著離子濃度的升高，對細胞膜的脅迫影響越大；白三葉MDA含量在Cd2＋濃度為0，1，50，100 mg／kg時差異顯著，但100和150 mg／kg處理下其MDA含量差異不顯著，這是在這一濃度處理下，對白三葉細胞膜的影響已經超出了植物所能耐受的最大范圍，細胞正常生理代謝受到影響，植物已喪失了基本的代謝功能，也可能是草坪草細胞逐漸適應了高濃度重金屬離子處理，誘導了植物體內抗氧化系統酶類活性增加或抗氧化物質積累，從而促進了植物清除超氧離子自由基的能力，從而在重金屬離子高濃度處理下其MDA含量不再繼續升高。

SOD是一種重要的活性氧防御酶，在消除超氧物自由基、減輕脂質過氧化作用和膜傷害方面起著重要作用［21］。POD是植物體內清除活性氧傷害的酶保護系統，清除超氧自由基，控制膜脂的過氧化作用，保護細胞膜的正常代謝［22］。SOD和POD酶活性的變化與植物體內氧化脅迫有關系［23，24］。

Cd2＋對草地早熟禾抗氧化酶活性影響均較大；Cd2＋處理對多年生黑麥草、高羊茅和白三葉抗氧化酶系統表現出低濃度影響較小，高濃度影響較大的趨勢，出現這種情況的原因可能是Cd2＋在低濃度時產生輕微刺激作用，在低濃度時對草坪草的正常生理代謝功能影響不大，但是當濃度達到一定程度后，反而會對植物機體造成一定程度的傷害，從而造成抗氧化酶活性的升高來對抗脅迫反應。

［1］陳飛.大麥鎘吸收與轉運機制的研究［D］.杭州：浙江大學，2013.

［2］Alloway B J.Heavy Metals in all sackle［M］.Glasgow and London，1990.

［3］Davies B E.Heavy Metals in Soils［M］.Blackie Academic＆ Professional，Glasgow，1990：216.

［4］于輝，王俊麗，向佐湘.鎘脅迫對白三葉和馬蹄金種子萌發的影響［J］.草原與草坪，2012，32（1）：39－41.

［5］廖鋼，張志飛，王俊麗，等.鎘脅迫對野老鸛草和長刺酸模種子萌發的影響［J］.草原與草坪，2011，31（1）：47－49.

［6］高菲菲.Cu、Zn、Cd、Pb對三種豆科植物生長的影響及其吸附性能的研究［D］.沈陽：東北大學.

［7］鄒琦.植物生理學實驗指導［M］.北京：中國農業出版社，2000.

［8］徐學華.北方地區7種主要綠化樹種對鉛鎘脅迫的生理生態響應［D］.保定：河北農業大學.

［9］武維華.植物生理學［M］.北京：科學出版社，2003.

［10］張瓊.鎘對黃瓜幼苗生長的影響［J］.漳州師范學院學報（自然科學版），2009（2）：118－122.

［11］燕平梅，章艮山.水分脅迫下脯氨酸的累積及其可能的意義［J］.太原師范專科學校學報，2000（4）：27－28..

［12］金明紅，馮宗瑋，張福珠.臭氧對水稻葉片膜脂過氧化和抗氧化系統的影響［J］.環境科學，2000，21（3）：2－5.

［13］袁祖麗.Cd，Pb污染對烤煙生理特性及生長發育的影響［D］.鄭州：河南農業大學.

［14］王志勇，廖麗，袁學軍.重金屬鉛對草坪植物的毒害研究進展［J］.草原與草坪，2010，30（2）：8－15.

［15］鄔飛波.大麥鎘積累和耐性基因型差異的機理研究［D］.杭州：浙江大學，2003.

［16］孫約兵，周啟星，王林，等.三葉鬼針草幼苗對鎘污染的耐性及其吸收積累特征研究［J］.環境科學，2009，30（10）：3028－3035.

［17］努扎艾提·艾比布，劉云國，曾光明，等.香根草對鎘毒害的生理耐性和積累特性［J］.環境科學學報，2009，29（9）：1958－1963.

［18］劉俊祥，孫振元，巨關升，等.結縷草對重金屬鎘的生理響應［J］.生態學報，2011，31（20）：6149－6156.

［19］李佳枚，石貴玉，韋穎.重金屬鎘對互花米草生長及生理特性的影響［J］.安徽農業科學，2011，39（4）：2174－2176，2182.

［20］樊明琴，李焰焰，苗杰，等.鎘脅迫對小麥種子萌發和幼苗生長的影響［J］.安徽農業科學，2010，38（26）：14239－14241.

［21］施國新，杜開和，解凱彬，等.汞、鎘污染對黑藻葉細胞傷害的超微結構研究［J］.植物學報，2000，42：373－378.

［22］張太平，潘偉斌.重金屬污染環境來源的玉米POD對Pb2＋的脅迫反應［J］.華南理工大學學報（自然科學版），2003，31（2）：5－8.

［23］Ruley A T，Sharma N C，Sahi S V.Antioxidant defense in a lead accumulating plant，Sesbania drummondii［J］.Plant Physiol Biochem，2004，42：899－906.

［24］Sun R L，Zhou Q X，Sun F H，et al.Antioxidantive defense and proline／phytochelatin accumulation in a newly discovered Cd－hyperaccumulator，Solanum nigrum L.［J］.Environ Exp Bpt，2007，60：468－476.