血管性癡呆大鼠海馬p38MAPK蛋白表達及使用普羅布考的研究

葉海波， 李仁云， 熊章津

(湖北省十堰市太和醫院/湖北醫藥學院附屬醫院， 湖北 十堰 442000)

血管性癡呆是由多種血管因素所引發的一種綜合 性病癥，嚴重損害腦組織同時可伴有認知功能障礙，是老年性癡呆中的主要類別之一［1］。有研究發現在血管性癡呆的發病進程中腦海馬神經元凋亡起著直接作用，在腦缺血組織中，p38MAPK可以經細胞凋亡的過程參與到腦組織的損傷［2］。普羅布考有較好的抗氧化及調血脂作用，同時其對炎性因子基因的表達有很好的抑制作用，更能夠抑制自由基所介導的炎性反應。本文分析了普羅布考對血管性癡呆大鼠行為學的影響，并觀察海馬p38 MAPK表達變化，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取63只3月齡雄性大鼠，平均體重(250±10)g，對63只大鼠進行適應性喂養1周后依照隨機數字表格法分成三組，分別為普羅布考組、假手術組以及模型組，每組21只。

1.2 所選試劑及藥物:普羅布考(齊魯制藥有限公司，國藥準字 H10980054);選擇美國(Santa Cruz)pp38MAPK兔抗大鼠多克隆抗體以及過氧化物酶標記羊抗兔IgG;上海研晶生物科技有限公司β－Tubulin;武漢博士德公司免疫熒光檢測試劑盒(SABC－FITC);購自美國Roche公司原位細胞凋亡檢測試劑盒等。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模及藥物治療:普羅布考組與模型組大鼠應用雙側頸總動脈永久結扎方法建立血管性癡呆模型，假手術組在將雙側頸總動脈分離后不予以結扎，術后逐層縫合皮膚，在術中與術后注意大鼠保暖，結束后將大鼠送回動物房。在手術1周后普羅布考組大鼠予以500mg/kg普羅布考液(溶于500mL濃度0.5%羧甲基纖維素鈉中)灌胃，1次/d;假手術組與模型組則予以2mL生理鹽水灌胃，1次/d。共8周。

1.3.2 水迷宮實驗法:選擇中科院藥物研究所研發的Morris水迷宮(DMS－2型)，分別測驗三組大鼠的行為學變化。每組分別取8只大鼠進行水迷宮隱蔽平臺實驗3d，測定大鼠的學習能力，詳細記錄大鼠的逃避潛伏期，之后撤除平臺，觀察三組大鼠在原平臺象限停留時間，測定大鼠的空間探索能力(記憶力)。

1.3.3 測定海馬區p38MAPK蛋白表達:三組每組各取6只大鼠，分別在行麻醉處理后斷頭，取出大鼠腦組織并分離海馬組織，勻漿并離心提取其蛋白行蛋白質定量分析，取其中50μg作為樣本，將其加注于10%濃度的丙烯酰胺膠約4%的成層膠上，行30mA電泳，時間為2h，溫度為室溫下，再將膠于4℃下轉化為醋酸纖維膜，過夜處理后將該膜與p－p38MAPK兔抗大鼠多克隆抗體在4℃下孵育約2h后再將其與過氧化物酶標記的羊抗兔IgG于室溫下進行反應，最后與ECL反應后將膜曝光并顯色處理。

1.3.4 TUNEL法測定細胞凋亡情況:三組各選大鼠6只作為測定對象，麻醉處理后快速斷頭取出腦組織并分離海馬組織，將其速凍后行冰凍切片，使用TUNEL法對細胞凋亡情況進行分析。

1.4 統計學方法:對所得數據應用SPSS15.0軟件進行統計學分析，計量資料使用均數±標準差(±s)表示，行單因素方差分析，多組間行F值檢驗，計數資料以率表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠行為學測定結果分析:模型組大鼠的平臺潛伏期顯著高于假手術組，而普羅布考組對應時間點下的平臺潛伏期模型組明顯降低(P＜0.01)。普羅布考組在原平臺象限的停留時間較模型組有明顯的提高(P＜0.01)，見表 1。

表1 三組大鼠行為學測定結果比較(±s)

表1 三組大鼠行為學測定結果比較(±s)

注:a 與假手術組比較，P＜0.01;b 與模型組比較，P＜0.01

組別 例數 平臺逃避潛伏期第1d 第2d 第3d 原平臺象限停留時間假手術組 8 26.37±4.16 21.38±5.13 17.84±3.52 36.11±3.47模型組 8 83.96±7.88a 79.32±8.67a 77.82±6.27a 18.76±5.97a普羅布考組 8 49.73±7.00ab 42.83±4.17ab 40.48±3.15ab 26.18±4.93ab F 值 －12.305 24.336 17.295 23.210 P 值 0.000 0.001 0.010 0.003

2.2 三組大鼠海馬組織p38MAPK蛋白表達及神經元凋亡情況:三組大鼠海馬組織內的p－p38MAPK表達即活化的p38MAPK水平存在顯著統計學差異(P＜0.01)，血普羅布考組較模型組明顯降低(P＜0.01);假手術組大鼠p－p38MAPK的表達較少。三組大鼠海馬神經元凋亡情況:模型組與普羅布考組大鼠的凋亡細胞數明顯增加，而假手術組大鼠僅有少量或者偶見凋亡細胞，普羅布考組凋亡細胞數明顯少于模型組(P＜0.01)，見表 2。

表2 三組大鼠海馬p38MAPK蛋白表達及神經元凋亡情況比較(±s)

表2 三組大鼠海馬p38MAPK蛋白表達及神經元凋亡情況比較(±s)

注:a與假手術組比較，P＜0.01;b 與模型組比較，P＜0.01

組別 例數 p－p38MAPK/β－action光密度值 凋亡細胞數假手術組 6 0.163±0.024 18.33±1.84模型組 6 0.876±0.103a 218.47±10.14a普羅布考組 6 0.507±0.048ab 161.66±9.73ab F 值 33.942 24.597 P 值 0.001 0.005

3 討論

血管性癡呆是因腦血管病變引發腦損傷從而進一步導致癡呆的病癥，缺血及缺氧性腦損傷或者出血性腦損傷造成的病理組織損傷是血管性癡呆的主要特征，且伴有進行性智能減退［3］。血管性癡呆僅次于阿爾茨海默病，是癡呆類型中的較為常見病癥，其發病率在近年來有上升趨勢。

馬大勇等［4］研究發現:動物在缺血再灌注時會激活p38MAPK信號轉導途徑，而p38MAPK信號轉導是細胞外刺激信號與效應基因表達的重要連接，是中轉也是橋梁，在機體炎癥及細胞周期的調控以及應激情況方面都有p38MAPK參與，所以p38MAPK與神經系統疾病的關聯成為近年研究熱點。p38MAPK分子為p38MAPK信號轉導途徑當中的主要酶成員，在細胞沒有受到刺激以前，p38MAPK會保持非磷酸化形態，并儲存在細胞質當中，一旦細胞被體內或者體外各種因素刺激時，例如炎性因子、缺血缺氧等刺激時，p38MAPK就會出現磷酸化形式，表現出活化性反應，p38MAPK被磷酸化激活，并從細胞質進入到細胞核內，對基因轉錄進行調節。

在研究結果提示普羅布考對血管性癡呆大鼠的認知能力有明顯調節作用，同時還觀察到應用普羅布考后，血管性癡呆大鼠的海馬CA1區細胞凋亡情況顯著改善，磷酸化的p38MAPK表達也顯著減少，提示對p38MAPK通路的抑制可能是普羅布考治療血管性癡呆的機制。近年發現，普羅布考對于抗動脈粥樣硬化、抗炎以及抗氧化應激也有明顯的療效。同時也具有防治心血管疾病及保護肝臟等多種作用，此外普羅布考對于神經元的重塑也有重要作用。

［1］ 姚細蕊.銀杏葉提取物治療血管性癡呆的療效觀察［J］.山西醫藥雜志，2012，(9):928～929.

［2］ 田新英，陳翔，汪婉，等.普羅布考對血管性癡呆大鼠認知功能及海馬組織SOD、MDA水平的影響［J］.中風與神經疾病雜志，2013，30(10):906～909.

［3］ Pallebage－Gamarallage MM，Galloway S，Takechi R，et al.Probucolsuppresses enterocytic accumulation of amyloid－β induced by saturatedfat and cholesterol feeding［J］.Lipids，2012，47(1):27～34.

［4］ 馬大勇，范吉平，朱陵群.3種擬血管性癡呆大鼠模型的比較［J］.北京中醫藥大學學報，2011，34(12):832～835.