不同蕎麥品種落粒基因的篩選

李 雪， 黃志強， 姜 君， 陳慶富

(貴州師范大學， 貴州 貴陽 550001)

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不同蕎麥品種落粒基因的篩選

李 雪， 黃志強， 姜 君， 陳慶富*

(貴州師范大學， 貴州 貴陽 550001)

為獲得蕎麥落粒性相關基因，分別選取甜蕎、苦蕎和金蕎的不同品種不同組織混合樣品進行轉錄組測序，通過數據庫比對、功能分析與功能注釋獲取與落粒性相關的Unigene。設計引物通過RACE方法擴增候選基因，測序后將候選基因全長序列提交到NCBI數據庫中，通過blast尋找候選基因的命名，用實時定量熒光PCR測候選基因的表達量。結果表明：得到6個候選基因，其中，根向光性蛋白基因、SOBIR1-like蛋白基因、NPR5-like蛋白基因主要在花器官的發育和形成過程中起調控作用，而SRG1-like蛋白基因、過氧化物酶基因和AGL蛋白基因主要在植物離區的形成和發育過程中起調控作用。NPR5-like蛋白基因在落粒品種與不落粒品種間的表達量差異最大。結論：NPR5-like蛋白基因在蕎麥落粒過程中起一定的調控作用。

蕎麥； 落粒性； 轉錄組； 實時定量熒光PCR

蕎麥屬于蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)[1]。有甜蕎(F.esculentumMoench)和苦蕎(F.tataricum(L.)Gaertn)2個栽培種[2]，其營養豐富，含有豐富的維生素和大量的黃酮類化合物[3-4]，能有效控制和治療多種疾病，增強身體的免疫力及預防癌癥，食用藥用價值高[5-7]。但在蕎麥的栽培過程中，落粒現象非常嚴重。落粒現象在豆科、禾本科、十字花科以及胡麻科等植物中廣泛存在，是植物在長期生存競爭及進化過程中為抵御惡劣外界環境及繁衍后代逐漸形成的一種適應機制[8-9]。落粒對農業生產造成巨大損失，大量種子在收獲前自然脫落，不僅增加采收難度，提高生產成本，而且使種子質量和產量均受到嚴重影響。因此，通過減少落粒現象提高蕎麥的產量和質量對于蕎麥生產和栽培具有重大意義。

近年來，研究者對不同植物的落粒現象進行了大量研究，早期主要側重于生理生化方面，通過長期的馴化實踐不斷地對作物器官脫落特性加以選擇，解決禾本科作物落粒、斷穗，豆類作物提前開莢等問題，減少了產量損失。隨著分子生物學的發展，解析離區發育和落粒現象的分子機制逐漸成為研究熱點[10]。研究發現，植物激素尤其是乙烯、ABA以及生長素之間的相互作用在植物落粒性中起著重要作用[11-14]。此外，在擬南芥中發現了1對控制花器官離區發育的功能重復基因BOP1和BOP2[15]，以及MADS-box基因AGL15和AGL18，其過表達可以延遲花器官的脫落[16-17]。Li等[18]通過QTL定位法研究水稻的落粒性時發現，SH4基因可控制離區的發育。但蕎麥的落粒性相關基因篩選前人尚未有研究，為進行蕎麥落粒相關基因篩選，在無參考基因組的情況下，筆者對不同蕎麥品種進行轉錄組測序，通過數據庫比對以及功能基因的分析獲得蕎麥落粒性相關的候選基因，然后利用實時定量熒光PCR獲得候選基因在不同蕎麥品種上的相對表達量差異，旨在探索蕎麥不同品種中與落粒性相關的基因，為降低蕎麥落粒性和提高其產量、品質提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 轉錄組測序材料

由于落粒性與葉柄處的離區相關，故取葉組織和灌漿期的花序組織作為測序樣本。于2013年5月在貴陽市永樂鄉貴州師范大學柏楊實驗基地分別取甜蕎、苦蕎和金蕎不同品種的葉組織和花序組織，置于EP管中，-80℃冰箱保存(表1)。

1.2 實時定量熒光PCR的材料

由于自然界中的金蕎均為落粒品種，而甜蕎和苦蕎均有落粒品種和不落粒品種，故于2014年10月在貴陽市永樂鄉貴州師范大學柏楊實驗基地分別取甜蕎、苦蕎和金蕎不同品種的花序，置于EP管中，-80℃冰箱保存(表2)。以金蕎作為落粒性品種的對照，與甜蕎和苦蕎的不同品種進行實時定量熒光PCR。

表2 用于實時定量熒光PCR的材料情況

1.3 轉錄組測序與Unigene的篩選

提取用于轉錄組測序的樣本總RNA，用OligoT探針引物分離帶有PolyA的mRNA，純化后反轉錄成cDNA。構建不同大小片段的cDNA文庫，進行基因組測序。把獲取的各樣品Reads采用Trinity軟件[19]進行組裝，獲得序列重疊群，將重疊群組成轉錄本，再將各樣品組裝結果中多個可變剪接的轉錄本聚類到1個基因，最后得到對應物種的1個Unigene庫。利用篩選得到的Unigene序列信息，預測得到對應Unigene的編碼序列和蛋白序列。使用IDE6 software對差異基因進行檢測，并對檢驗結果進行FDR校正，得到差異基因。對篩選出的差異表達的基因作表達模式聚類分析，將具有相同或相似表達行為的基因聚類。通過Unigene核酸序列與數據庫的blast比對，提取得到差異表達基因Nr，Nt，GO，COG，kegg，swissprot，trembl等庫的注釋，根據注釋結果選出與蕎麥落粒相關的Unigene。

1.4 RACE方法擴增基因全長序列

改良Trizol法[20]提取各蕎麥樣品總RNA，紫外分光光度計檢測其濃度和純度，-80℃保存。以各蕎麥樣品總RNA為模板，使用M-MLV Reverse Transcriptase(Takara, Japan)反轉錄成cDNA，簡并引物，通過降落式PCR反應克隆得到各候選基因保守區片段。分別設計上游外側和內側特異性引物GSP1和GSP2以及下游外側和內側特異性引物GSP1和GGSP2(表3)，利用3′-RACE外側引物(5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′)、3′-RACE內側引物(5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′)、5′-RACE外側引物(5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′)和5′-RACE內側引物(5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′)，通過3′-FullRACE Core Set with PrimeScript RTase試劑盒和5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒進行3′-RAEC和5′-RACE擴增。將保守區片段、3′-RAEC和5′-RACE片段拼接后獲得各候選基因的全長cDNA序列，設計特異引物(表4)進行擴增。將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen，USA)切膠回收，純化后連接到pMD18-T-simple載體(Takara,Japan)，轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆后，測序鑒定。

表3 候選基因上游和下游的內外側特異性引物序列

Table 3 The sequence of inside and outside specific primers of upstream and downstream regions of candidate genes

候選基因編號No.ofcandidategenes引物序列5'—3'Primerssequences1上游 GSP1CACACGGACTTCGCACAACC GSP2AAGAAGTTTACACTATTGGGTCCTG下游 GSP1GTGTAAACTTCTTGGGGAGCTTC GSP2GAATGTCATTAGAGCTTGGGTTG2上游 GSP1AATTACATCTGAAGCTTCTCGGG GSP2CCTGCCCACTCTAGCTTTCTG下游 GSP1TGTATCTTAGCATTTCCAGAAGGAG GSP2TGTATGTGAGCGCAGGTGAAG3上游 GSP1CCAAGACATTAGGAAAGCTGAATC GSP2GATCAGGCGGTGGTTCAAAG下游 GSP1AACGCTGTCCAGGTCGAAGAG GSP2TCTCCTTCTCCACGAATCCTG4上游 GSP1AAGTGTTATGAGTGGAAGAAGATTGC GSP2TCTACTTGAGTATTGGTATCCCGG下游 GSP1GCCTGATCGACAAACCAACG GSP2TTCTGCGGTTCTCATCGTCC5上游 GSP1AATTCTGCATGTGCTTCCTGG GSP2TCTTTAGGGTGATGCTGACAGG下游 GSP1TACGCCACAATCTTATCCATCG GSP2AAACGGATATGTCGATGTCAGC6上游 GSP1GGGTATACTTTTGTATTGGCGGA GSP2GGGGTTTATGTATTTATCGTGTCC下游 GSP1GAGGAGGTCATGGAAGAACGAG GSP2GGATCGGAGGCTGAGGAGAC

表4 候選基因的擴增特異引物

Table 4 Specific primers for amplification of candidate genes

候選基因編號No.ofcandidategenes引物序列5'-3'Primerssequences1上游 ATGTATTGTTAAGTCCTACCAAGCG下游 CTTCCATGGGAGGTGAGGATG2上游 AAGAGGCCGTGATTGTGTGAG下游 CGAATGAGTTTAAAGGCGTTG3上游 CGGATCCAAATGTAAGAACCG下游 GGGCGAGGTTCATGTTTCTG4上游 CACTCCACTTGGCAGCCG下游 ATCGAGAGCGAGATCAACGG5上游 AAAGATATGGGAGTATTGGTGGG下游 GCCTCTCCCCCTTACATCTCC6上游 GAGTTGAACTTGTTACAGACCGTC下游 GGAGTCTTTTGTTGACGGTCTG

1.5 生物信息學分析

將得到的各候選基因cDNA全長序列利用NCBI的BLAST在線軟件(http://blast.ncbi.nm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)進行比對，通過分析其覆蓋度和功能得到各候選基因的命名和相應的基因功能。

1.6 實時定量熒光PCR

設計實時定量熒光PCR檢測目的基因引物(表5)，由北京Invitrogen公司合成。利用改良Trizol法[18]提取各樣本RNA，紫外分光光度計檢測其濃度和純度，-80℃保存。采用PrimeScritTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄，獲得各樣品cDNA，-20℃備用。以5.8SRNA為內參基因，利用ABI7500型實時定量熒光PCR儀進行各樣本的實時定量熒光PCR試驗：首先用SYBRPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，ROX plus進行擴增，擴增程序為95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火40 s，45個循環；然后將各樣本cDNA混合后為模板進行5倍梯度的稀釋，取稀釋后各樣品用目的基因引物和內參基因引物進行擴增，同時在60～95℃進行融解曲線分析，根據擴增效率高和溶解曲線單峰原則篩選引物；最后將各樣品cDNA進行10倍稀釋后作為模板，分別用目的基因引物和內參基因引物擴增，同時在60～95℃進行溶解曲線分析。得到各樣本試驗結果后，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

表5 實時定量熒光PCR檢測目的基因引物

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序得到候選Unigene

將樣品進行轉錄組測序，共得到14.5 Gb的可用數據，通過數據庫比對與功能注釋的方法篩選得到6條與落粒相關的Unigene，功能分析與功能注釋表明，這些Unigene分別具有不同的功能(表6)，可能通過參與蕎麥不同的生理過程，調控蕎麥的落粒性。

2.2 RACE擴增候選基因及其生物信息學分析

從表7看出，這些基因均直接或間接地參與花器官以及離區的發育。其中，根向光性蛋白基因、SOBIR1-like蛋白基因和NPR5-like蛋白基因主要在花器官的發育和形成過程中起調控作用，而SRG1-like蛋白基因、過氧化物酶基因和AGL蛋白基因主要在植物離區的形成和發育過程中起調控作用。

表6 轉錄組結果中Unigene參與的生理功能

Table 6 Physiological function of Unigenes in transcriptome

Unigene序號Unigenenumber功能Unigenefunction1參與花器官的切除及花形態的發生2參與離層形成過程與器官衰老3參與頂端分生組織的發育與花粉成熟4參與分生組織的形成過程及花器官的切除5參與離層細胞壁的修飾6參與離層及細胞壁的形成

表7 候選基因的命名與功能

圖示 各基因實時定量熒光PCR相對定量

Fig. Relative quantitative result of different genes by RT-quantitative PCR

2.3 實時定量熒光PCR與候選基因的表達量

從圖示看出，6個基因在5個品種中的相對表達量不同，其中，根向光性蛋白和AGL蛋白2個基因在紅心金蕎、野甜蕎和野苦蕎3個落粒品種中的相對表達量較高，而SRG1-like蛋白和NPR5-like蛋白2個基因在晉蕎2號和甜自21號2個不落粒品種中的相對表達量較高，而NPR5-like蛋白基因在落粒品種與不落粒品種間的表達量差異最大。

3 結論與討論

研究選取不同蕎麥品種的不同組織作為轉錄組測序材料，在無蕎麥參考基因組的情況下，通過高通量測序分析與功能注釋獲得6個與蕎麥落粒性相關的Unigene。由于目前無蕎麥全基因組的測序工作，因此，無法直接通過轉錄組測序與比對直接獲得需要的基因，故通過轉錄組測序后在相關數據庫中進行比對，進行功能分析與功能注釋，從中篩選出與目的功能相關的Unigene是常用方法。然后設計RACE特異引物，通過RACE擴增的方法得到6個候選基因的全長序列，并將得到的全長序列提交到NCBI的blast進行比對，通過結構與功能分析確定6個候選基因的命名。經分析，這6個基因均參與植物重要的生物學過程，且直接或間接地參與花器官的發育或者離層的形成。然后通過實時定量熒光PCR得到6個基因在不同蕎麥品種中的相對表達量差異。結果表明，6個基因中在落粒品種與不落粒品種間表達量差異最大的為NPR5-like蛋白基因，且其在甜自21號和晉蕎2號2個不落粒品種中的表達量比在金蕎、野甜蕎和野苦蕎3個落粒品種中的表達量高。說明，NPR5-like蛋白基因在蕎麥落粒過程中起一定的調控作用。

已有研究表明，植物的落粒性與花器官的發育和離層細胞的形成和發育有關[21-22]。而本試驗中通過熒光定量結果分析得到的NPR5-like蛋白基因與前人研究一致。NPR5被稱作BOP2，編碼細胞質和核定位NPR1-like蛋白BOP2，能與BOP1互作。NPR6又被稱作BOP1，是蜜腺發育和正常離層區形成必需的蛋白。bop1/bop2雙突變體的葉子更持久，經常有小葉在葉柄上。BOP2和BOP1主要參與平衡植物的生長發育，與植物的落粒性有密切的關系[23]。因此，NPR5-like蛋白基因可能是通過與其蛋白家族其他相關基因相互作用，參與蕎麥的不同生理過程，從而影響花器官的發育和離層細胞的形成而參與蕎麥的落粒過程，調控著蕎麥不同品種的落粒性，但對于NPR5-like蛋白在蕎麥落粒過程中的詳細作用機制還有待進一步研究。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Screening of Seed-holding Gene in Different Buckwheat Varieties

LI Xue, HUANG Zhiqiang, JIAN Jun, CHEN Qingfu*

(GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China)

Six candidate genes related to seed-holding character of buckwheat were determined from different tissue ofF.esculentum,F.tataricumandF.dibotrysby RT-PCR to obtain genes related to seed-holding character of buckwheat. The results showed that root phototropism protein gene, SOBIR1-like protein gene, and NPR5-like gene have the regulating effect onthe floral organ development and formation process, but SRG1-like protein gene, peroxidase gene and AGL protein gene have the regulating effect onthe development and formation process of abscission zone in buckwheat mainly. There is significant difference in expression quantity of NPR5-like gene between shattering buckwheat variety and non-shattering buckwheat variety, which indicates that NPR5-like protein gene has a certain regulating effect onseed shattering process in buckwheat.

buckwheat; seed-holding; transcriptome; real-time quantitative PCR

2014-03-14； 2015-05-04修回

國家燕麥蕎麥現代農業產業技術體系專項“蕎麥育種崗位專項資金”(CARS-08-A4)；國家自然科學基金項目“蕎麥屬植物落粒性相關基因研究”(31060207)，“蕎麥落粒性的遺傳規律及其基因序列研究”( 31171609)；貴州百十千人才計劃

李 雪(1987-)，女，在讀碩士，研究方向:從事植物遺傳、進化與育種。E-mail:492733153@qq.com

*通訊作者：陳慶富(1966-)，男，教授，博士，從事植物遺傳、進化與育種工作。E-mail:cqf1966@163.com

1001-3601(2015)05-0227-0019-05

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