粗毛淫羊藿幼葉愈傷組織誘導及其總黃酮含量

張錦閣， 閆玉瑩， 黃 莎， 陳慶富

(貴州師范大學 生命科學學院， 植物遺傳育種研究所， 蕎麥產業技術研究中心， 貴州 貴陽 550001)

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粗毛淫羊藿幼葉愈傷組織誘導及其總黃酮含量

張錦閣， 閆玉瑩， 黃 莎， 陳慶富*

(貴州師范大學 生命科學學院， 植物遺傳育種研究所， 蕎麥產業技術研究中心， 貴州 貴陽 550001)

為了對粗毛淫羊藿野生資源的保護及淫羊藿黃酮離體生產體系提供技術參考，以粗毛淫羊藿幼葉為外植體，研究粗毛淫羊藿愈傷組織誘導的滅菌劑、消毒條件、培養基、激素配比和光照條件，并測定愈傷組織中總黃酮的含量。結果表明：利用粗毛淫羊藿幼葉進行愈傷組織培養，用2%的NaClO消毒14 min,接種于培養基MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L,在24℃光照強度為1 000 lx條件下進行誘導效果最好，繼代和保存應在適宜的黑暗條件下進行；誘導出的胚性愈傷組織總黃酮含量較高，達5.38%，與野生粗毛淫羊藿總黃酮含量想當，高于藥典規定的標準。

粗毛淫羊藿； 幼葉； 愈傷組織； 消毒； 總黃酮

粗毛淫羊藿(EpimediumacuminatumFranch)系小檗科(Berberidacea)淫羊藿屬(EpimediumL.)多年生宿根性草本植物。其全草入藥，辛、甘、溫，補腎陽，強筋骨，能治療風濕痛和更年期高血壓等癥[1]。地上、地下部分主要含有黃酮類化合物，夏、秋兩季采收。《貴州省中藥材標準》(1998版)收載其入藥。粗毛淫羊藿在貴州分布地域廣，蘊藏量大，質量較好，是中藥淫羊藿的主要原料植物[2]。隨著現代中藥產業的發展，以淫羊藿為主要原料的中成藥、民族藥產品不斷問世，市場對淫羊藿需求量也愈來愈大，其野生資源供不應求[3]。近年來，研究人員利用現代生物技術，通過細胞培養、組織培養生產植物的有效成分已在當歸、金蕎麥等多種植物上取得一定的成果[4-5]，但其在粗毛淫羊藿上的應用少見報道。因此，對粗毛淫羊藿愈傷組織誘導條件進行優化，同時對其有效成分黃酮類化合物進行定量分析，以探討建立粗毛淫羊藿懸浮培養的技術體系，為粗毛淫羊藿野生資源的保護及建立淫羊藿黃酮離體生產體系提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

粗毛淫羊藿采于四川省峨眉山大峨村，經貴州師范大學陳慶富教授鑒定，2006年移栽至貴州師范大學植物遺傳育種研究所藥圃。淫羊藿苷為大連美侖生物技術有限公司生產。紫外可見分光光度計為北京普析通用儀器有限責任公司生產。

1.2 外植體滅菌

于晴天中午采集粗毛淫羊藿幼葉作為外植體，浸入稀釋的洗潔精(或洗衣粉)液中浸泡5 min，再用軟刷或油畫筆輕輕洗刷外植體表面附著的塵土和菌體，流水沖洗2～3 h，在超凈工作臺上用75%的酒精消毒35 s，期間輕輕搖動，用無菌水清洗3～4次。選用升汞或次氯酸鈉對外植體進行滅菌：滅菌時，在消毒液中加入少量表面活性劑吐溫-80，使消毒劑更能滲入外植體的組織表面，從而達到較好的滅菌效果；用0.1%HgCl2滅菌，滅菌時間分別設為6 min、7 min、8 min和9 min；用2%NaClO滅菌，滅菌時間分別設為10 min、12 min、14 min和16 min。滅菌后用無菌水清洗5～6次，每次搖洗時間1 min。把消毒后的幼葉置于鋪有無菌濾紙的盤中，吸干幼葉表面水分，將切除邊緣的葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小片，接種在附加激素的MS培養基上(蔗糖30 g/L，瓊脂7.0 g/L，pH 5.8～6.0)，于24℃黑暗條件下培養，15 d后統計污染率、死亡率和存活率，比較消毒效果。

污染率=(污染外植體數/接種外植體數)×100%

死亡率=(未污染死亡外植體數/接種外植體數)×100%

存活率=(消毒后存活的外植體數/接種外植體數)×100%

1.3 愈傷組織的誘導

1.3.1 基本培養基誘導 將經最佳方案消毒處理的幼葉分別接種到MS、B5和LS基本培養基，并附加激素2,4-D 2.0 mg/L和6-BA 0.5 mg/L，置于黑暗和1 000 lx光照8 h或3 000 lx光照16 h，溫度24℃條件下培養，30 d后觀察統計愈傷組織的誘導情況，并計算誘導率。分別采用MS和B5培養基進行繼代培養，并附加不同濃度的激素，在24℃，黑暗條件下進行增殖培養，愈傷組織1個月繼代1次，計算愈傷組織的增殖系數。

誘導率=(形成愈傷組織的外植體個數/接種的外植體總數)×100%

增殖系數=繼代后成活愈傷質量/用于繼代愈傷質量

1.3.2 不同激素配比的誘導 以幼葉為外植體，分別以MS和B5為基礎培養基，附加激素2,4-D(1.0 mg/L，2.0 mg/L，4.0 mg/L)，6-BA(0.5 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L)，IBA(0 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L)，NAA(0 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L)，采用L9(34)正交試驗設計，共9個處理(表1)，考察不同激素配比對粗毛淫羊藿幼葉愈傷組織誘導的影響。

1.4 愈傷組織中總黃酮的測定

參照《中國藥典》2010年版用紫外分光光度法測定[6]。取愈傷組織于60℃烘箱中烘至恒重，研細，過40目篩，精確稱取0.2 g置于三角瓶中，精密加入75%乙醇20 mL,稱定質量，超聲處理1 h，再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取濾液0.5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻得樣品液。以甲醇為空白，參照紫外-可見分光光度法，在270 nm波長處測定吸光度。淫羊藿苷對照品以同樣方法測得吸光度，以淫羊藿苷對照品溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得線性回歸方程y=39.688x+0.101 5，r=0.999 6。

表1 粗毛淫羊藿幼葉不同激素配比誘導的L9(34) 正交試驗因子及水平

Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test of different hormone-induced ratio onE.acuminatumyoung leaves mg/L

水平Level因子 FactorA(2,4-D)B(6-BA)C(IBA)D(NAA)110.5002210.50.534211

總黃酮測定：分別取樣品溶液和對照品溶液，以甲醇為空白，參照紫外分光光度法[6]，在270 nm波長測定吸光度，代入回歸方程，計算含量。

1.5 統計分析

試驗所得數據用Excel進行簡單處理作圖，用Spss17.0軟件對正交試驗結果進行方差分析，同時用LSD法對每因素各處理水平之間進行多重比較；采用極差分析法分析正交試驗的結果。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理幼葉的滅菌效果

從表2看出，用HgCl2消毒處理7 min時，組織成活率最高為40%；而用NaClO消毒處理14 min時，組織成活率最高為63.3%,顯著高于其他處理(P<0.05)。總體上，2種消毒處理的成活率均隨消毒時間的增加先升高后降低，HgCl2的污染率比NaClO處理的低，但死亡率卻高出很多。各種消毒處理均不能達到污染率為0，升汞雖是一種極有效的殺菌劑，但對于植物本身傷害較大，易殘留。綜合考慮組織塊損傷、死亡率和成活率，最佳消毒處理應為2%的NaClO消毒14 min。

表2 不同消毒處理粗毛淫羊藿幼葉的滅菌效果

注：表中同列的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

Note: Lowercase letters.

2.2 不同培養基和激素配比對愈傷組織的誘導效果

2.2.1 基本培養基 從表3看出，接種27 d后，外植體在MS、B5培養基中均能誘導出結構疏松、淡黃色胚性愈傷組織，且MS誘導率為68%，B5的誘導率為66%，差異不顯著(P>0.05)；LS培養基上的外植體誘導率最差，僅為16%，顯著低于MS和B5的誘導率(P<0.05)。MS和B5培養基均適于淫羊藿幼葉形成愈傷組織，可進行最佳激素配比的進一步篩選。

2.2.2 激素配比 從表4看出，與B5基本培養基相比，MS基本培養基更適合誘導粗毛淫羊藿幼葉的愈傷組織，最佳的是組合4，愈傷組織誘導率高，達85%，愈傷組織結構致密，呈淡黃色或淺綠色，其因素位級組合為A2B1C2D3。為了進一步反映各因子之間的差異，以便獲得最佳激素水平，經方差和極差分析(表5)，4種因子對幼葉愈傷組織作用顯著(P<0.01)，依次是2,4-D>6-BA>IBA>NAA,而對于各因素，K值愈大影響程度愈大。因此，以MS為基礎培養基的最佳激素組合為2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L。

表3 基本培養基對粗毛淫羊藿葉愈傷組織的誘導效果

表4 MS和B5培養基附加不同激素配比粗毛淫羊藿幼葉愈傷組織的誘導率

Table 4 Callus induction of young leaves ofE.acuminatumleaves with different ratio of hormones on medium MS

組合Combination因素FactorABCD愈傷組織誘導率/%CallusinductionMSB5110.50033.012.22110.50.519.816.03121124.530.0420.50.5185.061.05211061.042.062200.535.033.0740.510.556.845.08410142.052.09420.5057.38.8

表5 附加不同激素配比各因素誘導率的極差分析結果

Table 5 Callus induction of young leaves ofE.acuminatumleaves with different ratio of hormones on medium MS

項目Item因素 FactorABCDK125.76758.26736.66750.433K260.33340.93354.03337.200K352.03338.93347.43350.500R34.56619.33417.36613.300K'119.40039.40032.40021.000K'245.33336.66728.60031.333K'335.26723.93339.00047.667R25.93315.46710.40026.667

注：表中，K和R為MS培養基附加不同激素配的極差分析結果，K′和R′為B5培養基附加不同激素配的極差分析結果。

Note:KandR, range analysis results of MS;K′ andR′, range analysis results of B5.

2.2.3 光照條件 從表6看出，在不同光照條件下，粗毛淫羊藿幼葉均能誘導愈傷組織，但愈傷組織的數量、顏色、質地和出現時間均存在一定的差異。1 000 lx光照和全黑暗條件下的誘導率顯著高于3 000 lx(P<0.05)光照的，隨著光照時間和光照強度的增加，愈傷組織生長受到抑制，褐化數和死亡率均增加。因此，粗毛淫羊藿的愈傷組織誘導適合在光照強度較弱、光照時間短或全黑暗的條件下進行，但之后進行的繼代培養發現，光照條件下的胚性愈傷組織容易褐化死亡。因此，以黑暗條件對胚性愈傷組織進行繼代和保存較好。

2.2.4 繼代培養基 表7表明，以B5培養基繼代的愈傷組織褐化較嚴重，且結構變致密，胚性細胞較少。以MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L組合的繼代培養，增殖系數為2.1，顯著高于其他培養基(P<0.05)，且培養出的愈傷組織較疏松，顆粒狀，胚性細胞多，有利于繼代培養與保存，為最適增殖愈傷組織培養基。

2.3 愈傷組織中的總黃酮含量

在愈傷組織繼代培養過程中，出現了不同類型的愈傷組織(圖示)，選取各種不同顏色、質地的愈傷組織測定黃酮含量結果表明：黃酮含量以淺黃色疏松顆粒狀的愈傷組織(圖示-C)含量較高，為5.38%(高于藥典規定的不得少于5%)，綠色致密狀愈傷組織(圖示-A)的含量居中，為3.27%，乳白色致密愈傷組織(圖示-B)的含量最低，為2.93%。因此，為了在以后的懸浮體系中獲得高產黃酮含量愈傷組織細胞，在以后的繼代培養中應選擇表面干燥、顆粒狀、生長旺盛、質地疏松的淺黃色愈傷組織(圖示-C)。

表6 不同光照條件粗毛淫羊藿幼葉愈傷組織的誘導效果

表7 粗毛淫羊藿愈傷組織繼代培養的增殖效果

圖示 粗毛淫羊藿幼葉誘導的愈傷組織

Fig. Callus induced fromE.acuminatumyoung leaves

3 結論與討論

1) 在植物組織培養中，外植體的消毒處理是試驗能否成功的首要條件，滅菌的時間長短也直接影響外植體的污染率和存活率[7-8]。羅莉等[9]對柔毛淫羊藿幼葉采用0.1%的HgCl2滅菌3 min。本研究結果表明，2%的NaClO進行14 min的消毒處理，成活率為63.3%，效果最好。

2) 作為建立再生體系的前提和基礎，愈傷組織的誘導非常關鍵。植物生長調節劑是愈傷組織誘導和分化的重要因素之一，能否誘導出優良的愈傷組織，使用的植物生長調節劑的種類和濃度最為重要[10]。中、低濃度的生長素與低濃度的細胞分裂素相結合，能更好地誘導愈傷組織[11]。本研究結果表明，在NAA、IBA中加入低濃度的6-BA和高濃度的2,4-D，能有效地促進愈傷組織的誘導和生長，并隨著2,4-D濃度的升高，愈傷組織的誘導率呈先上升后下降的趨勢，在2,4-D濃度為2.0 mg/L時誘導率達最大，這與周海琴[12]等對巫山淫羊藿愈傷組織誘導、韓素菊[3]等對箭葉淫羊藿愈傷組織誘導的研究結果一致。盛茂銀等[13]對粗毛淫羊藿進行愈傷組織誘導，最佳外植體是幼葉。韓素菊等[3]對箭葉淫羊藿、羅莉等[10]對柔毛淫羊藿進行的愈傷組織誘導的最佳外植體也均是幼葉，且越靠近葉片中脈的組織，越容易誘導出愈傷組織，組織越嫩越容易誘導出。王晶[14]等對朝鮮淫羊藿研究認為，莖尖的誘導率最高。本研究結果表明，采用幼葉為外植體，以MS為基本培養基，激素組合為2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L，于24℃，弱光或黑暗條件下培養，愈傷組織誘導的效果最好，而胚性愈傷組織應在黑暗條件下繼代和保存。這與之前研究者對其他品種的淫羊藿試驗得出的最佳誘導培養基方案有所不同，可能與外植體的生理狀態、幼嫩程度、取材時期和材料的生長環境不同所致。

3) 試驗誘導的胚性愈傷組織總黃酮含量較高達5.38%，與野生粗毛淫羊藿總黃酮含量相差0.5%左右，同時也高于藥典所規定的標準(5.0%)。因此，本研究可為今后建立穩定細胞懸浮體系生產高產淫羊藿總黃酮奠定基礎。

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(責任編輯： 聶克艷)

Callus Induction ofEpimediumacuminatumYoung Leaves and Its Flavonoid Content

ZHANG Jinge, YAN Yuying, HUANG Sha, CHEN Qingfu*

(ResearchCenterofBuckwheatIndustryTechnology,InstituteofPlantGeneticsandBreeding,SchoolofLifeScience,GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China)

To provide technical references for protection of wildE.acuminatumresources and in vitro production system of flavonoids, the young leaves ofE.acuminatumwere used as explants for callus induction and its factors including different sterilization agent, medium, hormone combinations and illumination conditions which affect the callus induction ofE.acuminatumwere studied. Besides, the content of flavonoids in the calli was studied by means of the ultraviolet spectrophotometric analysis. The results indicate that the callus culture ofE.acuminatumleaves can be induced under the following conditions:disinfection of 2% NaClO for 14 minutes, the medium MS + 2,4-D 2.0 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L+ IBA 0.5 mg/L+ NAA 1 mg/L, at 24℃ 1 000 lx illumination conditions. The subculture and preservation is much appropriate under dark conditions. Total flavonoid content of induced embryonic calli is up to 5.38%, higher than that of pharmacopoeia standard.

Epimediumacuminatum; young leaf; callus; sterilize; total flavonoids

2015-01-23； 2015-05-10修回

國家現代化農業產業技術體系蕎麥育種崗位科學家專項資金項目“蕎麥育種”(CARS-08-A4)；國家自然科學基金項目“蕎麥屬植物落粒相關基因研究”(31471562)；國家自然科學基金委項目“蕎麥屬植物種子蛋白亞基基因序列及其在染色體上分布研究”(31171609)

張錦閣(1987-),男,在讀碩士,研究方向：植物遺傳育種。E-mail:gezi9777@163.com

*通訊作者：陳慶富(1966-),男,教授,博士，從事植物遺傳育種研究。E-mail:cqf1966@163.com

1001-3601(2015)05-0242-0079-04

S567

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