荷斯坦奶牛HSP 70-1基因多態性與熱應激的關聯性

吳瓏韜， 曹涵文， 潘建東， 甘乾福， 石沈炳， 梁學武*

(1.福建農林大學 動物科學學院， 福建 福州 350002； 2.福建省建陽市吉翔牧業有限公司， 福建 福州 354200)

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荷斯坦奶牛HSP70-1基因多態性與熱應激的關聯性

吳瓏韜1， 曹涵文1， 潘建東2， 甘乾福1， 石沈炳2， 梁學武1*

(1.福建農林大學 動物科學學院， 福建 福州 350002； 2.福建省建陽市吉翔牧業有限公司， 福建 福州 354200)

為我國南方荷斯坦奶牛抗熱應激品種的選育提供理論依據，使用PCR-SSCP方法，對327頭荷斯坦奶牛HSP70-1基因編碼區進行單核苷酸多態性檢測，并分析其與熱應激的關聯性。結果表明：HSP70-1基因在1112位點發生C→A突變，有CC、CA和AA基因型，其中CA型個體血清三碘甲腺原氨酸(T3)顯著低于其他基因型個體(P<0.05)，甲狀腺素(T4)顯著低于AA型個體(P<0.05)，直腸溫度顯著低于CC型個體(P<0.05)；在3390位點發生T→C突變，有TT、TC和CC基因型。1112位點的皮質醇(Cor)及3390位點各指標基因型間差異均不顯著(P>0.05)。CA型個體對抗熱應激的能力更強，1112多態位點可以作為提高奶牛抗熱應激能力的一個潛在遺傳標記。

熱應激蛋白70； 單鏈構象多態性； 血生化； 直腸溫度

夏季高溫高濕氣候條件是制約我國南方奶牛業發展的一個重要因素。由于高產奶牛代謝旺盛，并且皮膚汗腺不發達，當處于熱應激時奶牛直腸溫度上升、脈搏及呼吸頻率加快[1]；采食量下降，使機體營養攝入量減少，內分泌機能紊亂，導致產奶量明顯降低，并且牛奶中乳脂率、乳糖率、乳蛋白率也會下降，嚴重的熱應激會引起奶牛休克、死亡[2]；熱應激會降低公牛的精子活力，對受精率也有很大影響[3]。因此，選育抗熱應激能力強的奶牛品種對于發展南方奶牛業具有重要意義。

熱應激蛋白70(HSP70)是一種分子伴侶蛋白，在奶牛發生熱應激反應時起重要的保護作用。在不良環境因素的影響下，HSP70能夠保護機體，使動物適應環境的變化。HSP70能增強機體的熱耐受能力、維持細胞內環境穩定，在提高抗氧化能力、免疫應答等方面也有重要作用[4]，HSP70基因表達水平與熱應激強度和持續的時間呈正比關系[5]。HSP70基因的多態性會影響熱應激條件下影響血清超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)等的濃度[6]。目前，南方夏季高溫高濕氣候條件給奶牛業生產造成的影響研究集中于合理建造、改造牛舍，改善日糧以及生理代謝分析等方面，對于奶牛個體基因差異以及適應力的研究較少[7]。為此，筆者于2014年7月使用PCR-SSCP方法，對327頭荷斯坦奶牛HSP70-1基因進行多態性檢測，分析了HSP70-1基因多態性與血液生化指標及奶牛直腸溫度的關聯性，為我國南方荷斯坦奶牛抗熱應激品種的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

動物：荷斯坦奶牛327頭，胎次1～6胎，均來自福建省建陽市吉翔牧業。試劑：Taq PCR Mastermix、血液基因組DNA提取試劑盒，均購自北京天根生化科技有限公司；血液三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、皮質醇(Cor)試劑盒，均購自北京北方生物技術研究所。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴增

于2014年7月10—11日尾靜脈采血10 mL，使用 ACD抗凝劑保存于-20℃冰箱。用DNA提取試劑盒提取DNA。根據NCBI登錄(登錄號：AY 149619.1)的荷斯坦奶牛HSP70-1基因設計2對引物(表1)，由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反應體系(20 μL)：Taq PCR Mastermix 10 μL，H2O 8 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR條件：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，57℃和61℃退火30 s，72℃延伸35 s，38個循環；72℃延伸7 min。PCR產物保存于4℃冰箱。

表1 荷斯坦奶牛HSP70-1基因的PCR引物

1.3 PCR產物檢測及測序

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，判斷目的條帶是否清晰。取PCR產物3 μL與變性上樣緩沖液8 μL混合，98℃變性10 min，立即置于冰上放入-20℃冰箱中冷卻10 min，上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳條件為90V、時間13 h，銀染顯色。使用凝膠成像系統拍照，判斷是否具有特異性目的條帶。發現有特異性條帶的樣品，由上海生工生物科技有限公司進行測序，使用BLAST軟件進行序列比對。

1.4 直腸溫度及血清指標含量測定

于7月8—11日連續4天14:00左右使用獸用體溫計測定奶牛直腸溫度，同時在牛舍8個位置離地面2 m處放置干濕溫度計，分別測定牛舍溫濕度，計算平均值和溫濕指數(THI)。

THI=0.72(T1+T2)+40.6

式中，T1、T2分別表示干濕溫度計上干、濕球度數。血清三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、皮質醇(Cor)按試劑盒說明書測定。

1.5 數據統計分析

使用軟件Excel統計基因頻率和基因型頻率，對等位基因的哈代-溫伯格平衡性進行卡方檢驗。對基因型效應分析建立一般線性模型：

Yijm=μ+Ti+Gj+eijm

式中，Yijm表示個體表型記錄，Ti為胎次效應，Gj為標記基因型效應，eijm為隨機誤差。使用軟件SPSS 20進行HSP70-1多態位點基因型與血清生化指標、直腸溫度的關聯分析，結果用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 牛舍溫濕指數

經測定，7月8—11日的平均氣溫分別為34.3℃、33.7℃、36.1℃和35.7℃，溫濕指數(THI)分別為86.25、86.32、88.26和86.68。Fuquary J W等[8]研究表明，當7290時奶牛處于嚴重熱應激。由此表明，試驗奶牛處于中度熱應激狀態。

2.2 PCR產物及多態性

PCR擴增產物經過1%瓊脂糖電泳，分別在247 bp和216 bp位置出現清晰條帶(圖1)。根據銀染結果和測序結果判斷，引物P1產物在1112位點存在C→A突變，形成CC、CA和AA基因型(圖2～4)，基因型頻率分別為66.9%、28%和5.1%，C為優勢等位基因(表2)；引物P2產物在3390位點存在T→C突變，形成TT、TC和CC基因型(圖2～4)，基因頻率分別為63.7%、30.8%和5.5%，T為優勢等位基因(表2)。從表3看出，1112和3390突變位點的多態信息含量分別為0.261 3和0.251 9，均屬于中度多態。經卡方檢驗，2個多態位點均符合Hardy-Weinberg平衡。

注：M為100 bp Ladder DNA marker，1～10為擴增產物。

Note: M, 100 bp DNA marker; 1～10, amplification products.

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

圖2 P1和P2擴增片段聚丙烯酰胺電泳凝膠銀染圖譜

圖3 P1 PCR擴增產物測序結果(從上至下分別是CC、CA和AA型)

圖4 P2 PCR擴增產物測序結果(從上至下分別是TT、TC和CC型)

表2 荷斯坦奶牛1112和3390位點的基因頻率和基因型頻率

表3 基因座位點的群體遺傳特征

表4 突變位點與血清生化指標濃度和直腸溫度的關聯性

注：同位點同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters in the same column indicate significance of difference at 0.05 level.

2.3HSP70-1基因多態位點與血清生化指標和直腸溫度的關聯性

從表4看出，1112多態位點與血清T3濃度、T4濃度及直腸溫度存在顯著相關，并且CA型個體的血清T3含量顯著低于CC型和AA型，血清T4含量顯著低于AA型，CC型和CA型個體的直腸溫度均顯著低于AA型，皮質醇各基因型間差異均不顯著。3390多態位點與所測項目無顯著相關。

3 結論與討論

3.1HSP70-1基因多態性對奶牛熱應激血清參素的影響

甲狀腺分泌的T3、T4可以提高基礎代謝，增加產熱，促進蛋白質合成，且T3比T4具有更強的生物活性。奶牛處于熱應激時，甲狀腺代謝能力下降，T3、T4分泌量降低以減少自身產熱來對抗熱應激對機體的損害[9]；在熱應激狀態下，不同泌乳階段奶牛血清的T3、T4濃度均低于非熱應激期[10]。陳強等[11]研究表明，奶牛HSP70基因作為抗熱應激選育的分子標記不太理想，這可能與其樣本量小有關。研究結果表明，荷斯坦奶牛HSP70-1基因1112位點的CA型個體血清T3濃度低于其他型個體，并且直腸溫度低于CC型和顯著低于AA型個體(P<0.05)，表明CA型個體對抗熱應激的能力更強，1112多態位點可以作為提高奶牛抗熱應激能力的一個潛在遺傳標記，但還需要擴大樣本和檢測HSP70蛋白表達水平來進一步驗證。

皮質醇是由腎上腺皮質分泌的一類激素，可以促進糖、脂肪和蛋白質分解，使血糖濃度增加[12]。目前，關于皮質醇在熱應激時期的變化報道不一，一般認為，急性熱應激會使血清皮質醇升高，慢性熱應激時下降。荷斯坦奶牛HSP70-1基因2個多態位點血清皮質醇濃度CC、TC基因型個體最低，但與其他基因型個體間差異均不顯著。

3.2HSP70-1基因多態性對直腸溫度的影響

直腸溫度是判斷奶牛是否處于熱應激狀態的重要指標，奶牛直腸溫度遺傳力在0.25～0.65，在熱應激狀態下直腸溫度較低的奶牛具有更強的抗熱應激能力[13]。李建國[14]等認為，可以將奶牛直腸溫度作為判斷是否處于熱應激的依據。研究結果表明，荷斯坦奶牛HSP70-1基因1112位點CA型個體直腸溫度顯著低于其他基因型個體，說明CA型個體在夏季高溫時具有更強的抗熱應激能力。

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(責任編輯： 馮 衛)

Relationship Between Heat Stress and Polymorphism ofHSP70-1 Gene in Holstein Cow

WU Longtao1, CAO Hanwen1, PAN Jiandong2, GAN Qianfu1, SHI Shenbing1, LIANG Xuewu1*

(1.CollegeofAnimalSciences,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002; 2.JixiangAnimalHusbandryLimitedCompany,Fuzhou,Fujian354200,China)

The relationship between heat stress and polymorphism of HSP70-1 gene was studied by analyzing single nucleotide polymorphism in HSP70-1 coding sequence of Holstein cow by pcr-sscp to provide the theoretical basis for breeding of Holstein cow with resistance to heat stress in Southern China. Results:There is C→A mutation (CC, CA and AA genotypes) on 1112 locus of HSP70-1 gene. T3, T4and rectal temperature of the individuals with CA genotype are lower than other individuals with other genotypes, individuals with AA genotype and individuals with CC genotype significantly. There is T→C mutation (TT, TC and CC genotypes) on 3390 locus of HSP70-1 gene. There is no significant difference in Cor on 1112 locus and different indexes on 3390 locus between different genotypes. The 1112 polymorphism locus can be used as a potential genetic marker to improve resistance to heat stress of Holstein cow because individual with CA genotype has of strong resistance to heat stress.

heat stress protein 70; single-stranded conformation polymorphism (SSCP); blood biochemistry; rectal temperature

2014-12-30； 2015-02-28修回

科技型中小企業技術創新基金項目“南方荷斯坦奶牛高產耐熱新品系建立與培育”(13C26213502913)；福建省科技計劃項目“南方荷斯坦奶牛高產耐熱新品系的繁育與示范 ”(2014S0069)

吳瓏韜(1990-)，男，在讀碩士，研究方向：動物營養與飼料科學。E-mail：wulongtao789@qq.com

*通訊作者：梁學武(1960-)，男，教授，從事反芻動物營養研究與生產工作。E-mail：faulxw2000@163.com

1001-3601(2015)05-0259-0153-04

S823

A

畜牧·獸醫·水產

Animal Husbandry·Veterinary·Fishery