乙醇激活ALDH2對2型糖尿病大鼠睪丸損傷的影響

李徽徽，于　影，賀文欣，周艷梅，柴繼俠(蚌埠醫學院.組織學與胚胎學教研室，.生理學教研室，安徽蚌埠　33030)

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乙醇激活ALDH2對2型糖尿病大鼠睪丸損傷的影響

李徽徽1，于影2，賀文欣1，周艷梅1，柴繼俠1
(蚌埠醫學院1.組織學與胚胎學教研室，2.生理學教研室，安徽蚌埠233030)

中國圖書分類號: R-332; R322.64; R587.1; R587.2; R977. 3

摘要:目的觀察乙醇激活乙醛脫氫酶2(ALDH2)對2型糖尿病大鼠睪丸損傷的影響。方法健康♂SD大鼠高糖高脂飲食聯合低劑量鏈脲佐菌素(STZ)(35 mg·kg－1)制備2型糖尿病大鼠模型。成模后，將大鼠隨機分為正常對照組、2型糖尿病組、乙醇+ 2型糖尿病組(n =6)。乙醇+ 2型糖尿病組大鼠先給予體積分數0. 025乙醇喂養1周后，改用體積分數0. 05乙醇繼續喂養7周;正常對照組和2型糖尿病組大鼠常規喂養8周。8周后，測定血糖、糖化血紅蛋白、血清睪酮、睪丸質量系數等指標，觀察睪丸組織結構改變，檢測睪丸組織ALDH2 mRNA、轉化生長因子β1(TGF-β1)mRNA水平和TGF-β1陽性率的變化。結果與正常對照組比較，2型糖尿病組大鼠血糖、糖化血紅蛋白和睪丸質量系數均明顯升高，血清睪酮水平明顯降低，睪丸組織中部分生精小管萎縮，各級生精細胞減少，排列疏松，睪丸間質細胞減少，睪丸組織ALDH2 mRNA水平明顯減少，TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1陽性率明顯升高。給予乙醇干預后，與2型糖尿病組比較，乙醇+ 2型糖尿病組大鼠血糖、糖化血紅蛋白和睪丸質量系數降低，血清睪酮水平升高，病理改變減輕，睪丸組織ALDH2 mRNA水平明顯升高、TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1陽性率明顯降低。結論激活ALDH2可能通過下調TGF-β1的表達，減輕2型糖尿病對睪丸的損傷。

關鍵詞:2型糖尿病;乙醛脫氫酶2;睪丸;轉化生長因子β1;乙醇;鏈脲佐菌素;大鼠

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.015.html

柴繼俠(1976－)女，碩士，副教授，碩士生導師，研究方向:神經疾病和糖尿病的機制研究，Tel: 0552-3175282，E-mail: chaichai123456@163.com

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病群，其中90%以上為2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)［1］。糖尿病并發癥可涉及多種器官，隨著糖尿病發病率的升高及發病年齡的降低，糖尿病并發男性生殖功能障礙作為典型的并發癥之一倍受關注。

乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是線粒體內一種重要的醛類氧化酶，是體內重要的抗氧化應激的保護因子之一，與生物氧化關系密切，廣泛分布于心臟、肝臟、腎臟和睪丸等組織中［2］。Murata等［3］觀察到少量或適量的外源性乙醇可以激活ALDH2的表達。已有實驗觀察到激活ALDH2可以減輕糖尿病大鼠心肌損傷［4］，腎臟損傷［5］和肝臟損傷［6］。大量研究顯示，線粒體ALDH2具有抗氧化應激損傷的作用，但激活ALDH2是否對糖尿病大鼠的睪丸損傷有保護作用至今尚無報道。本研究通過低劑量乙醇激活ALDH2，觀察是否能在T2DM大鼠睪丸組織中發揮保護作用，為其臨床新用途提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物和材料4～5周齡清潔級♂SD大鼠18只，體質量(100±10)g，蚌埠醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號: 0005237，許可證號: SCXK2009(蘇)－0001。

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自美國Sigma公司;免疫組化SP試劑盒，小鼠抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，DAB顯色劑均購自武漢博士德生物科技有限公司。大鼠血清睪酮定量ELISA試劑盒購自美國R＆D公司; TRIzol試劑購自Invitrogen公司;逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自MBI Fermentas公司; ALDH2、TGF-β1、β-actin引物均由上海生物工程公司合成。引物序列見Tab 1。

Tab 1　The primer squences for each gene

1.2方法

1.2.1 T2DM模型制備及分組大鼠適應性飼養1周，隨機分為T2DM模型組和正常對照組(NC組)。T2DM模型組大鼠每日給予高脂高糖乳劑灌胃，NC組大鼠每日給予生理鹽水灌胃。6周后，禁食12 h，T2DM模型組大鼠一次性腹腔注射新配制的STZ 35 mg·kg－1，分別于給藥72 h后和7 d后尾靜脈采血測血糖，以兩次隨機血糖≥16. 7 mmol·L－1確定為T2DM模型建立成功［7］; NC組大鼠給予等量枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。將T2DM模型組中造模成功的大鼠隨機分為2型糖尿病組(T2DM組)和乙醇+ 2型糖尿病組(EtOH + T2DM組)。EtOH + T2DM組大鼠先給予體積分數為0. 025乙醇適應性喂養1周后，改用體積分數0. 05乙醇繼續喂養7周［5］; NC組和T2DM大鼠常規喂養8周。

3組大鼠干預8周后，清晨空腹稱體重，采集大鼠血液及睪丸組織標本，提前死亡的大鼠排除在外。

1.2.2空腹血糖及糖化血紅蛋白測定尾靜脈取血測定空腹血糖(FBG)水平，水合氯醛麻醉后從右側頸總動脈采血1. 5 mL，置于肝素抗凝管中，臺式離心機4℃，4 000 r·min－1離心5 min，分離紅細胞，測定糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

1.2.3血清睪酮測定右側頸總動脈取血2 mL，臺式離心機4℃，3 000 r·min－1離心15 min后，收集血清，－80℃冰箱保存。ELISA檢測大鼠血清睪酮水平。

1.2.4睪丸組織病理學檢查大鼠處死后，速取睪丸并稱重，計算睪丸質量系數(睪丸重量/體重)。左側睪丸－80℃冰箱保存，后期做RT-PCR。右側睪丸置于4%多聚甲醛固定液中固定，石蠟包埋，切成5 μm薄片，蘇木精伊紅染色。

1.2.5 RT-PCR檢測大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA和TGF-β1 mRNA水平采用TRIzol一步提取左側睪丸組織總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增條件: 95℃預變性3 min后，以①95℃50 s變性，②β-actin退火溫度59. 4℃50 s; ALDH2退火溫度59. 8℃50 s; TGF-β1退火溫度58. 5℃50 s，③72℃60 s，反應30個循環，最后一輪延伸10 min。將PCR擴增產物與溴酚蘭混勻，于15 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色。在GIS凝膠處理系統對凝膠圖像拍攝記錄，并使用圖像分析軟件掃描凝膠中每一擴增條帶吸光度做半定量分析，以目的基因與內參對照的吸光度比值(ALDH2/β-actin，TGF-β1/β-actin)表示mRNA相對表達量。

1.2.6免疫組化測定睪丸組織中TGF-β1的表達

睪丸組織切片脫蠟、水化，枸櫞酸鹽高溫修復抗原，過氧化氫封閉。加一抗，4℃過夜，二抗37℃孵育，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，鹽酸乙醇分化，氨水返藍、脫水、透明、封片。高倍顯微鏡下隨機觀察10個視野，生精小管的細胞中出現TGF-β1棕色顆粒的細胞數占細胞總數的百分比為TGF-β1陽性率。

2　結果

除NC組外，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠均出現多食、多飲、多尿、消瘦等癥狀。

2.1各組大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平的變化與NC組相比，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠FBG和HbA1c明顯升高(P ＜0. 01)，與T2DM組相比，EtOH + T2DM組大鼠FBG和HbA1c水平降低(P＜0. 05，Tab 2)。

Tab 2　Levels of fasting blood glucose(FBG)and glycosylated hemoglobin(HbA1c)in different groups(±s，n =6)

2.2各組大鼠睪丸質量系數(TW/BW)、血清睪酮的變化與NC組相比，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠睪丸質量系數升高，血清睪酮明顯降低(P＜0. 05～P＜0. 01)，與T2DM組相比，EtOH + T2DM組大鼠睪丸質量系數降低，血清睪酮升高(P＜0. 05，Tab 3)。

Tab 3　Ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and level of testosterone in different groups(±s，n =6)

2.3各組大鼠睪丸組織病理學改變NC組大鼠睪丸組織中生精小管內各級生精細胞豐富，排列有序，多為6～7層，管腔中有大量的精子。T2DM組大鼠睪丸組織中生精小管萎縮，生精細胞數量少，排列紊亂，多為2～3層。EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中生精小管內各級生精細胞較T2DM組明顯增多，細胞排列較為有序，管腔中有少量精子(Fig 1)。

Fig 1　Seminiferous tubules of different groups(HE×400)A: Seminiferous tubules of rats in NC; B: Seminiferous tubules of rats in T2DM; C: Seminiferous tubules of rats in EtOH + T2DM

2.4各組大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA和TGF-β1 mRNA水平的變化與NC組相比，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯降低，TGF-β1 mRNA水平明顯升高(P ＜0. 01)，與T2DM組相比，EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯升高，TGF-β1 mRNA水平明顯降低(P＜0. 01，Fig 2、3)。

Fig 2　Expression of ALDH2 mRNAin testis tissue of different groups＊＊P＜0. 01 vs NC;##P＜0. 01 vs T2DM

Fig 3　Expression of TGF-β1 mRNAin testis tissue of different groups＊＊P＜0.01 vs NC;##P＜0.01 vs T2DM

2.5各組大鼠睪丸組織中TGF-β1表達的變化與NC組相比，T2DM組和EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中TGF-β1陽性率明顯升高(P＜0. 01)，與T2DM組相比，EtOH + T2DM組大鼠睪丸組織中TGF-β1陽性率明顯降低(P＜0. 01，Fig 4)。

Fig 4　Expression of TGF-β1(A)and positive rate of TGF-β1(B)in testis tissue of different groups＊＊P＜0.01 vs NC;##P＜0. 01 vs T2DM

3　討論

糖尿病作為一種慢性進行性內分泌病及代謝性病，主要表現為其復雜的并發癥對身體健康造成嚴重的危害，生殖系統損傷是其慢性并發癥之一。目前，人和動物實驗都證明，2型糖尿病對雄性生殖系統的影響以睪丸的組織形態、生精功能和性激素水平的變化為主要表現。本研究通過高糖高脂飲食聯合低劑量STZ制備2型糖尿病大鼠模型，通過長期大量高糖、高脂飲食造成大鼠胰島素抵抗，聯合STZ，高度選擇性破壞動物的胰島β細胞，導致2型糖尿病形成［8］。造模后，大鼠出現多飲、多食、多尿的癥狀，大鼠FBG、HbA1c和睪丸質量系數均明顯升高，大鼠睪丸體積縮小，血清睪酮水平明顯降低，睪丸組織中部分生精小管萎縮，各級生精細胞減少，排列疏松，并有晚期長形精子細胞滯留現象，睪丸間質中的睪丸間質細胞相對較少，與2型糖尿病患者的癥狀較一致，說明造模成功。

目前認為，糖尿病的高血糖導致的氧化應激反應是糖尿病并發癥發生發展的主要機制。有研究表明，糖尿病并發生殖系統損傷，導致生精細胞凋亡，生精能力減弱、睪丸間質細胞產生睪酮能力下降等均與氧化應激有關。ALDH2作為體內重要的抗氧化應激的保護因子之一，與生物氧化關系密切。Ohta等［9］研究發現，ALDH2活性缺失型PC12細胞更容易受到脂質過氧化的損傷，且細胞存活率低。Weng等［10］發現ALDH2基因敲除的小鼠更容易受乙基叔丁基醚影響，造成生殖系統損傷。本研究觀察到2型糖尿病大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯降低，并與睪丸組織結構的損傷、血清睪酮的減少相關并呈依賴性。提示糖尿病引起的生殖系統損傷可能與睪丸組織中ALDH2降低有關。對2型糖尿病大鼠給予ALDH2激活劑低劑量乙醇干預8周后，觀察到大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯升高，FBG、HbA1c和睪丸質量系數降低，血清睪酮水平升高，睪丸組織中生精小管內各級生精細胞較T2DM組明顯增多，提示激活ALDH2可改善糖尿病大鼠生殖系統的損傷。

轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種細胞分泌的具有免疫抑制作用的負調控因子［11］，在睪丸內多數細胞(包括睪丸支持細胞、睪丸間質細胞、肌樣細胞及生精細胞)均有表達。睪丸中TGF-β1主要由支持細胞和間質細胞分泌，通過自分泌和旁分泌作用，調節睪丸間質細胞的類固醇合成和增殖［12－14］，以及誘導生精細胞的凋亡［15］。多項研究證明，哺乳動物的TGF-β1對精子的產生和發育起調控作用［16］。糖尿病病程中，高血糖可刺激TGF-β1的大量表達［17］。TGF-β1過表達可以抑制睪丸的生精作用，促進生精細胞凋亡。本研究發現，T2DM組大鼠睪丸組織中TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1表達較NC組明顯增高，并與睪丸組織結構的損傷、血清睪酮的減少相關，并呈依賴性。因此，下調睪丸TGF-β1表達將有助于減輕2型糖尿病并發生殖系統損傷。對2型糖尿病大鼠給予ALDH2激活劑低劑量乙醇干預8周后，大鼠睪丸組織中ALDH2 mRNA水平明顯升高，TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1表達較T2DM組明顯降低，睪丸組織結構和血清睪酮明顯改善，提示激活ALDH2可能通過對抗睪丸組織氧化應激損傷，下調睪丸組織中TGF-β1的表達，發揮睪丸保護作用。

因此我們得出結論，糖尿病大鼠睪丸組織中TGF-β1表達升高，而低劑量乙醇激活ALDH2可以下調TGF-β1的表達，從而減輕睪丸的損傷。ALDH2是如何調控TGF-β1的表達，還有待進一步研究。隨著研究的逐步深入，利用低劑量乙醇干預或其他干預激活ALDH2，有望為臨床上預防、治療糖尿病生殖系統損傷提供新的思路。

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Effects of activation of ALDH2 by ethanol in testis injury of type 2 diabetic rats

LI Hui-hui1，YU Ying2，HE Wen-xin1，ZHOU Yan-mei1，CHAI Ji-xia1
(1.Dept of Histology and Embryology; 2.Dept of Physiology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China)

Abstract:Aim To observe the effects of activation of aldehyde dehydrogenase 2(ALDH2)by ethanol on testis injury of type 2 diabetic rats.Methods Type 2 diabetic rats model were established by high-fat diet combined with low-dose streptozotocin(STZ)injections.After the success of modeling，the rats were randomly divided into 3 groups(n = 6): normal control group(NC)，type 2 diabetes group(T2DM)and ethanol + type 2 diabetes group(EtOH + T2DM).Rats of EtOH + T2DM were treated with low-dose ethanol，then rats of NC and T2DM were given normal diet for 8 weeks.After 8 weeks，the levels of the fasting blood glucose(FBG)，glycosylated hemoglobin(HbA1c)and testosterone were tested，and the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)was calculated.Morphological changes of testis tissue were observed by optical microscope.The levels of ALDH2 mRNA and transforming growth factor β1(TGF-β1)mRNA in testis tissue were measured.The expression of TGF-β1 in testis tissue was observed by immunohistochemical staining，then the positive rate of TGF-β1 was calculated.

Results Compared with NC，the levels of FBG， HbA1c and TW/BW increased significantly and the level of testosterone decreased significantly in T2DM.The morphological observation showed that some seminiferous tubules atrophied，spermatogenic cells decreased and arrangemented loosely，Leydig cells decreased in testicular interstitial.The level of ALDH2 mRNA in testis tissue decreased significantly，and the level of TGF-β1 mRNA and the positive rate of TGF-β1 in testis tissue increased significantly.However，compared with T2DM，the levels of FBG，HbA1c and TW/BW decreased，and the level of testosterone increased and the damage of testis tissue was attenuated in EtOH + T2DM.The level of ALDH2 mRNA in testis tissue increased significantly，and the level TGF-β1 mRNA and the positive rate of TGF-β1 in testis tissue decreased significantly.Conclusion Activating ALDH2 can protect testis in type 2 diabetic rats，which may be related to the downregulation of TGF-β1 expression.

Key words:type 2 diabetes mellitus; aldehyde dehydrogenase 2; testis; transforming growth factor β1; ethanol; streptozotocin; rats

作者簡介:李徽徽(1981－)，女，碩士，講師，研究方向:干細胞與組織工程，Tel:0552-3175282，E-mail: dearlxh@163.com;

基金項目:高校省級自然科學研究重點項目(No KJ2014A166);安徽省高等學校自然科學研究項目(No KJ2015B013by);蚌埠醫學院自然科學研究資助重點項目(No BYKL1402ZD);蚌埠醫學院自然科學研究項目(No Byky1213)

收稿日期:2015－03－07，修回日期:2015－04－10

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0962－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.015