神經肽Urocortin2對嗎啡成癮大鼠VTA神經元放電及DA能神經傳遞的影響

姚紅月，宋斐然，劉春娜，李鳳華，劉新宇(.遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧錦州　000，.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州　000，.中國醫科大學，遼寧沈陽　000)

?

神經肽Urocortin2對嗎啡成癮大鼠VTA神經元放電及DA能神經傳遞的影響

姚紅月1，2，宋斐然3，劉春娜1，李鳳華2，劉新宇2
(1.遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧錦州121000，2.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000，3.中國醫科大學，遼寧沈陽110001)

中國圖書分類號: R-332; R322.81; R338.1; R749. 61; R971. 2; R977. 6

摘要:目的明確神經肽urocortin2(UCN2)在嗎啡成癮中抑制丘腦腹側背蓋區(ventral tegmental area，VTA)神經活動的機制。方法建立嗎啡成癮大鼠模型，采用七管微電泳方法，電泳UCN2對嗎啡成癮大鼠VTA神經元自發放電的改變，及UCN2對多巴胺(dopamine，DA)能神經元簇發放電模式的影響，明確UCN2在VTA神經元中與DA存在匯聚作用。另外，給予促皮質激素釋放因子(coticortropin-releasing factor，CRF)受體阻斷劑及蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)抑制劑，明確UCN抑制嗎啡成癮中發揮關鍵作用。結果UCN2使82%(31/38)嗎啡成癮大鼠VTA神經元放電頻率減慢，平均放電頻率由微電泳前的(20. 89±2. 86)Hz減少到(13. 66±3. 93)Hz，給藥前后放電頻率降低具有顯著性(P＜0. 01)，UCN2抑制作用可被PKA抑制劑H89及CRF-2R阻斷劑AST-2B取消。另外，微電泳UCN2可抑制嗎啡成

癮大鼠VTA中DA神經元的爆發放電，AST-2B可增強DA的興奮效應。結論UCN2與CRF-2R結合后，通過PKA信號途徑，抑制VTA內DA神經元異常放電，在嗎啡類藥物成癮中發揮抑制作用，為其用于臨床治療阿片類藥物成癮提供理論依據。

關鍵詞:嗎啡成癮;優洛可啶;丘腦腹側背蓋區;多巴胺;神經元;微電泳;蛋白激酶A網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.018.html

劉新宇(1977－)，男，博士，副教授，研究方向:神經內分泌學，通訊作者，Tel: 0416-4673465，E-mail: springnanaliu @163.com

嗎啡等阿片類藥物反復應用可造成耐受、依賴和成癮，中斷給藥出現戒斷綜合征、強迫覓藥行為及戒斷后焦慮等精神神經系統癥狀。在阿片類藥物的成癮過程中，中腦腹側被蓋區(ventral tegmental area，VTA)起到重要的作用［1］。VTA靠近黑質與紅核，含有大量DA能神經元。針對嗎啡強化和依賴效應主要通過VTA的DA系統介導，VTA神經元的異常興奮是嗎啡成癮的關鍵環節，但目前機制尚不清楚［2］。神經內分泌活性肽UCN是近年來發現的促皮質激素釋放因子(coticortropin-releasing factor，CRF)肽類家族的一個新成員［3］。UCN具有與CRF相似的生物活性，通過下丘腦－腺垂體－腎上腺軸，促進腺垂體分泌腎上腺皮質激素，調節應激、應急反應、抗焦慮、鎮靜等作用。UCN作為一種新型的小分子神經活性肽，通過自分泌和(或)旁分泌途徑，其作用是廣泛的，相應作用機制也是多方面的［4］。有少量報道表明，UCN參與酒精成癮及戒斷后焦慮和覓藥等行為的應激性反應［5］。但UCN對嗎啡成癮VTA神經元電活動及DA系統的影響未見報道，且機制也不明確。因此，本實驗采用七管玻璃微電極細胞外記錄方法，微電泳UCN2及CRF2受體抑制劑AST對VTA神經元放電情況的影響，同時也觀察了UCN2對VTA中DA能神經遞質傳遞的影響，以探討VTA內存在的復雜的神經纖維聯系及各種神經遞質之間的相互作用，從而為VTA神經元放電異常及發作性疾病的診治提供電生理學方面的依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，50只，體質量180～220 g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號: SCXK(遼)2003－0007。隨機分為嗎啡成癮模型組40只和對照組10只。模型組采用劑量序貫遞增法腹腔注射鹽酸嗎啡(Tab 1)建立大鼠嗎啡成癮模型，對照組在相同條件下給予生理鹽水，12 d后采用納洛酮(5 mg·kg－1)誘導嗎啡成癮戒斷模型［6］。

Tab 1　Morphine dosage of administration

1.2七管玻璃微電極的拉制細胞外記錄及微電泳采用51－217型微管拉制儀(美國STOELTING公司)所拉制的7管玻璃微電極。中心管尖端直徑在4～8 μm，電阻為5～12 MΩ，管內灌注含1%滂胺天藍的NaCl溶液(3. 0 mol·L－1)作為神經元放電活動的引導電極;外周管電阻為20－100MΩ，外周管內灌注下列藥物，包括: UCN2(10－6mol·L－1); astressin2B-AST-2B(CRF-2受體阻斷劑，10－6mol· L－1); DA及其非選擇性阻斷劑α-flupenthixol(FLU，10－5mol·L－1)，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)及抑制劑(H-89，10－5mol·L－1)。

1.3實驗方法上述實驗動物用20%烏拉坦(1 g ·kg－1)麻醉后，于腦立體定位儀上行常規開顱。根據Paxions Watson大鼠腦圖譜，確定VTA核團位置，坐標為前囟后5. 20～6. 80 mm，中線旁開0. 20～0. 80 mm，腦表下7. 0～8. 0 mm。應用微電極推進器將七管微電極緩慢插入VTA，神經元單位放電經DAM80微電極放大器采集及濾波后顯示于示波器上，再經Spike2生物信號采集系統(英國CED公司)輸入計算機并處理，生成序列密度直方圖。觀察嗎啡成癮大鼠VTA神經元放電情況，之后觀察UCN2及AST-2B對VTA神經元放電影響。另外，微電泳DA及其阻斷劑期間，給予UCN2對VTA神經元多巴胺能神經傳遞的影響;微電泳PKA及抑制劑H-89，進一步觀察UCN2對嗎啡成癮大鼠VTA神經元影響是否通過PKA發揮作用。為排除可能發生的電流影響，只要注入生理鹽水引起的任何放電改變，則該資料不列入統計之內。

1.4數據處理及統計記錄微電泳藥物前、后VTA神經元放電頻率改變，微電泳藥物后放電頻率變化/% =(微電泳藥物期間放電頻率－微電泳前20s放電頻率)/微電泳前20s放電頻率×100%，電泳藥物后放電變化超過±30%為有效臨界值。

采用SPSS 13. 0統計軟件進行統計學處理。所有數據以用±s表示。組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗進行統計學處理。

2　結果

實驗中，共計觀察了52個嗎啡成癮大鼠VTA神經元的自發放電活動，其自發放電頻率快而且不規則，VTA神經元放電頻率在10～25Hz之間，多為單個爆發式放電。

2.1微電泳UCN2及AST對VTA神經元自發放電的影響本結果中，共觀察了38個嗎啡成癮大鼠的VTA神經元。微電泳UCN2(10－6mol·L－1，20nA，20s)使82%(31/38)神經元自發放電頻率減慢，對7個神經元無作用。38個受試VTA神經元的平均放電頻率由微電泳前的(20. 89±2. 86)Hz減少到(13. 66±3. 93)Hz，給藥前后放電頻率降低具有顯著性(P＜0. 01)。實驗中發現，UCN2的抑制作用較明顯，幾乎沒有潛伏期，但存在后作用。此外，在22個VTA神經元中單獨微電泳AST(10－6mol· L－1，20nA，20s)，可使73%(16/22)VTA神經元自發放電頻率升高。受試VTA神經元放電頻率由微電泳前的(21. 64±2. 82)Hz升高到(24. 25±2. 30)Hz(P＜0. 01)，在微電泳UCN2造成抑制效應的20個神經元中，微電泳UCN2(20nA，40s)期間給予AST(20nA，20s)可拮抗UCN2的抑制效應，使80%(16/20)對UCN2產生抑制效應的神經元放電頻率明顯加快，放電頻率由微電泳AST前的(13. 35± 1. 89)Hz增加到(17. 80±2. 53)Hz，微電泳前后平均放電頻率改變具有顯著性(P＜0. 01)。AST的起效迅速，無潛伏期，可引起爆發式放電，并可見雙向動作電位增加(Fig 1A，1B)。

Fig 1　Effects of UCN2 on VTA neuronA: Effects of UCN2(10－6mol·L－1，20nA，20s)and AST-2B on VTA neuron.＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0. 01 vs UCN2 group，B: Effects of UCN2 on VTA neuron spontaneous firing rates.AST-2B was administrered during the period of UCN2.

2.2微電泳UCN2及AST對DA能神經傳遞的影響微電泳DA可使嗎啡成癮大鼠VTA神經元興奮性進一步升高，而給予DA非選擇性阻斷劑可拮抗其興奮效應。選取對DA產生興奮效應的24個VTA神經元進行研究。在微電泳DA(20nA，40s)期間，在第20s微電泳UCN2(20nA，20s)，使受試神經元中的79%(19/24)的放電頻率明顯降低。受試VTA中DA神經元的放電頻率由微電泳UCN2前(25. 57±1. 64)Hz減少到(13. 42±1. 60)Hz，給藥前后放電頻率差異有顯著性(P＜0. 01)。微電泳DA的阻斷劑FLU可使DA神經元放電頻率明顯降低，在微電泳期間給予UCN2(20nA，20s)，對受抑制的VTA神經元中放電頻率無明顯影響，平均放電頻率由微電泳UCN2前的(13. 88±1. 80)Hz變化到(13. 46±1. 78)Hz，給UCN2前后差異無顯著性(P ＞0. 05)(Fig 2A，2B)。

2. 3 UCN2及AST對DA元中PKA的影響對DA產生興奮效應的19個VTA神經元進行研究。在微電泳DA(20nA，80s)期間，在第20s微電泳H89(20 nA，40s)，使受試神經元中的79%(15/19)的放電頻率由微電泳H89前(25. 50±1. 58)Hz減少到(16. 17±1. 47)Hz，給藥前后放電頻率差異有顯著性(P＜0. 05)。在微電泳H89的第20 s，再微電泳UCN2(20nA，20 s)，受試的VTA神經元中的52%(10/19)放電頻率略降低，由(15. 80±2. 41)Hz改變為(15. 45±1. 28)Hz但給藥前后差異無顯著性(P＞0. 05)(Fig 3A，3B)。

3　討論

實驗中發現，嗎啡成癮大鼠VTA神經元放電頻率明顯增加，呈爆發式放電，而神經肽UCN2能使其神經元放電頻率明顯減慢，提示UCN2對嗎啡成癮大鼠VTA神經元的放電起抑制作用。研究表明［7］，阿片類藥物能直接或間接刺激VTA，產生神經元異常高頻放電，VTA是愉悅系統或獎賞系統的重要部分，當產生獎賞行為時，能夠刺激VTA神經元興奮性放電，產生藥物依賴成癮，本實驗結果進一步提示，UCN2可以通過抑制VTA神經元異常高頻放電，對阿片類藥物成癮起到抑制及治療作用。

Fig 2　Effects of UCN2 on DA neuron

Fig 3　Effects of UCN2 on PKA pathwayA: Effects of UCN2(10－6mol·L－1，20nA，20s)and H89 on VTA's DA neuron.＊＊P＜0. 01 vs normal group;##P＜0.01 vs h89 group; B: Effects of UCN2 on VTA's dopaminergic neuron spontaneous firing rates via PKA pathway.

實驗中單獨微電泳選擇性CRF2R阻斷劑AST-2B可增加受試VTA神經元的放電頻率。微電泳UCN2期間，其抑制作用可被AST-2B所拮抗，結果提示UCN2對嗎啡成癮大鼠VTA神經元的抑制效應可能是通過與CRF2R結合后而產生。UCN有3種形式: UCN1、UCN2、UCN3。CRF受體主要有CRF-1R、CRF-2R兩種，新近發現的非哺乳動物CRFR3受體，均為7次跨膜的G蛋白偶聯受體，CRFR1受體能高親和力地與CRF、UCN1肽結合。而UCN2、UCN3只對CRFR2受體有特異結合特征。UCN與CRF-R2結合后，具有抗氧化、抗衰老、抗焦慮、憂郁等多種生理作用及藥理功能［8－9］。有研究表明，Urocortin在腦損傷過程中具有神經保護作用，特別是在藥物成癮、神經退行性疾病中發揮重要調節作用，但目前機制尚不十分明確［10］。因此，本實驗結果進一步提示，UCN2在對嗎啡類藥物成癮中主要是通過與CRF-R2結合發揮抑制作用。

實驗結果表明，DA能投射纖維對VTA神經元有興奮作用，UCN2可以拮抗DA的興奮效應，且給予AST對DA興奮效應具有一定協同作用，提示UCN2與VTA神經元中CRF2受體結合后，拮抗DA在嗎啡成癮中的興奮毒性。有報道表明［11］，VTA中的DA神經元異常興奮，誘發VTA神經元過度爆發式放電，產生藥物依賴性。UCN2是CRF肽類家族的成員，有研究表明，UCN2可增加實驗鼠的迷宮探索能力，增強學習和記憶能力，具有抗焦慮作用及很強的鎮靜效應。UCN2與酒精成癮有密切關系，微量核團注射UCN2能減少小鼠自我供給酒精的量，在酒精戒斷過程中發揮作用。嗎啡是通過阿片受體作用于VTA上的DA能神經元，從而引起DA釋放增加，減弱或消除GABA能神經元對DA神經元的抑制作用，進一步促進DA釋放。因此，本實驗結果進一步提示，UCN2能夠抑制VAT中DA神經元活動的物質將有望成為減輕嗎啡成癮的有效藥物。

UCN2與CRF-2R結合后是如何引起效應的呢?其保護VTA神經元作用的機制，很可能與阻斷了神經遞質DA的興奮毒性作用有關。有限的研究資料也表明: UCN與酒精成癮有密切關系，微量核團注射UCN能減少小鼠自我供給酒精的量［10］;可卡因戒斷引起的長時程增強可被CRFR1和CRFR2受體拮抗劑阻斷［11］;在酒精戒斷過程中，大鼠杏仁核細胞外CRF明顯升高。上述結果均提示: UCN可能通過CRF-R2受體參與酒精成癮及戒斷后焦慮和覓藥等行為的應激性反應［12］。另外，VTA的DA能神經元成簇放電導致其突觸末梢DA釋放量瞬時大量增加，已被公認是編碼獎賞效應的功能信號，但誘發DA能神經元產生簇放電的神經機制尚不完全清楚［7］。在本實驗中證實，微電泳PKA阻斷劑H89后，再給予UCN2，可使VTA中DA神經元的放電頻率略降低，但給藥前后差異無顯著性，該結果提示，UCN2與CRF-2R結合后，進而通過激活蛋白激酶A引起效應。

本實驗結果表明，UCN2可以通過作用于CRF-2R能夠抑制VTA神經元放電活動，降低神經元的過度興奮性，并且降低DA能興奮毒性，提示在嗎啡成癮病理情況下，UCN2可以起到神經元保護作用，研究結果為藥物成癮機制提供新的實驗依據，對臨床防治提供新的思路。

參考文獻:

［1］Charalampopoulos I，Androulidaki A，Minas V，et al.Neuropeptide urocortin and its receptors are expressed in rat Kupffer cells ［J］.Neuroendocrinology，2006，84(1):49－57.

［2］胡蓉蓉，宋睿，蘇瑞斌，等.多巴胺D3受體與阿片成癮研究進展［J］.國際藥學研究雜志，2013，10(40):5525－6.

［2］Hu R R，Song R，Su R B，et al.Dopamine D3 receptor and opioid addiction: researeh advances［J］.J Int Pharm Res，2013，10(40):5525－6.

［3］Walczewska J，Dzieza-Grudnik A，Siga O，Grodzicki T.The role of urocortins in the cardiovascular system［J］.J Physiol Pharmacol，2014，65(6):753－66.

［4］Voltolini C，Battersby S，Novembri R，et al.Urocortin 2 role in placental and myometrial inflammatory mechanisms at parturition ［J］.Endocrinology，2015，156(2):670－9.

［5］Ryabinin A E，Yoneyama N，Tanchuck M A，et al.Urocortin 1 microinjection into the mouse lateral septum regulates the acquisition and expression of alchhol consumption［J］.Neuroscience，2008，151(3):780－90.

［6］鄭久明，張迪，劉新宇，劉春娜.神經肽urocortinⅡ對嗎啡成癮大鼠中腦腹側被蓋區神經元自發放電的影響［J］.中國藥理學通報，2014，30(5):735－6.

［6］Zheng J M，Zhang D，Liu X Y，Liu C N.Effects of neuropeptide urocortinⅡon spontaneous discharge of ventral tegmental area in morphineaddicted rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30(5): 735－6.

［7］湯賢春，楊培潤，吳明松，等.嗎啡精神依賴大鼠獎賞環路多巴胺遞質含量和D2受體表達的變化［J］.中國藥物依賴性雜志，2014，23(1):19－23.

［7］Tang X C，Yang P R，Wu M S，et al.Changes of dopamine content and D2 receptor expression in reward circuit in morphine dependent rats［J］.Chin J Drug Depend，2014，23(1):19－23.

［8］Lawrence K M，Jackson T R，Jamieson D，et al.Urocortin-from Parkinson's disease to the skeleton［J］.Int J Biochem Cell Biol，2014，23(60C):130－8.

［9］Stengel A，Taché Y.CRF and urocortin peptides as modulators of energy balance and feeding behavior during stress［J］.Front Neurosci，2014，18(8):52.

［10］Pan W，kastin A J.Urocortin and the brain［J］.Pregr Neurobiol，2008，84(2):148－56.

［11］Guan X，Zhang R，Xu Y，Li S.Cocaine withdrawal enhances long-term potentiation in rat hippocampus via changing the activity of corticotrophin－releasing factor receptor subtype 2［J］.Nuroscience，2009，161(3):665－70.

［12］Valdez G R，Sabino V，Koob G F.Increased anxiety-like behavior and ethanol self-administration in dependent rats: reversal via corticotrophin-releasing factor-2 receptor activation［J］.Alcohol Clin Exp Res，2004，28(6):865－72.

Effects of neuroactive peptide urocortin 2 on VTA neuron's spontaneous discharge and DA-ergic neurotransmission in morphine addiction

YAO Hong-yue1，2，SONG Fei-ran3，LIU Chun-na1，LI Feng-hua2，LIU Xin-yu2
(1.Dept of Pharmacology，Liaoning Medical University; 2.The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou Liaoning 121000，China; 3.The China Medical University，Shenyang 110001，China)

Abstract:Aim To investigate the inhibitory effects of urocortin2(UCN2)on ventral tegmental area(VTA)nervous activity of morphine addiction rats and the mechanism.Methods Morphine addiction rats and the microiontophoresis method were used to observe the effects of UCN2 on VTA neuron' s spontaneous discharge changing rule，as well as the inhibitory effects of UCN2 on DA neuron' s cluster spontaneous discharge，to identify UCN2 and DA on the same VTA neuron.Morever，the inhibitor of corticotropin-regulating factor' s receptor(CRF-2R)and the blocker of protein kinase A(PKA)，AST-2B and H89，were used to investigate the effects of UCN2 on VTA neuron' s of morphine addiction rats.Results UCN2 could inhibit the firing rate 82%(31/38)of the tested VTA neuron(P＜0. 01)，the discharge frequency changed from(20. 89±2. 86)Hz to(13. 66±3. 93)Hz(P＜0. 01).Further，the inhibitor of PKA，AST-2B and H89 could ablolish the inhibitory effects of UCN2.Morever，the excitatory firing of VTA neurons was attenuated by addition of UCN2，while AST application could inhibit the UCN2's inhibitory effects.Conclusion UCN2 could regulate the effects of VTA via PKA pathway and may thereby contribute to the improvement of drug addiction.

Key words:morphine addiction; urocortin; ventral tegmental area; dopamine; neuron; microelectrophoresis; protein kinase A

作者簡介:姚紅月(1979－)，女，碩士生，研究方向:神經藥理學，E-mail:43948255@ qq.com;

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81201037)

收稿日期:2015－02－28，修回日期:2015－03－17

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0979－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.018