miR-125b甲基化在同型半胱氨酸促進血管平滑肌細胞增殖中的作用

劉現梅，曹成建，田　玨，趙　麗，孔繁琪，周龍霞，陳久凱，王艷華，楊曉玲，賈月霞，姜怡鄧(寧夏醫科大學.基礎醫學院、.檢驗學院，寧夏銀川　750004)

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miR-125b甲基化在同型半胱氨酸促進血管平滑肌細胞增殖中的作用

劉現梅1，曹成建2，田玨1，趙麗2，孔繁琪1，周龍霞1，陳久凱2，王艷華2，楊曉玲1，賈月霞1，姜怡鄧1
(寧夏醫科大學1.基礎醫學院、2.檢驗學院，寧夏銀川750004)

中國圖書分類號: R322.74; R329.24; R341.7; R543.5; R977. 4

摘要:目的探討同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)促進血管平滑肌細胞增殖中miR-125b甲基化的作用。方法原代培養人臍靜脈平滑肌細胞(VSMCs)，并分為空白對照組(0 μmol·L－1Hcy)，不同濃度Hcy干預組(50、100、200及500 μmol·L－1Hcy)，以熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-125b的表達變化;利用miR-125b前體和抑制劑轉染VSMCs 后MTT法檢測細胞增殖活性;生物信息學分析miR-125b啟動子區CpG島分布情況，巢式降落式甲基特異性PCR(nt-MSP)法檢測miR-125b甲基化狀態的變化;并利用DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷(AZC)干預細胞后再次檢測miR-125b的表達。結果與對照組相比，100，200及500 μmol· L－1Hcy可使miR-125b的表達水平降低，差異有顯著性(P ＜0. 01); miR-125b前體可以抑制VSMCs增殖，而miR-125b抑制劑可以促進VSMCs增殖(P＜0. 01);以miR-125b基因上游3 700 bp作為研究對象，生物信息學分析發現miR-125b啟動子區含有一個長度為792bp(1881-2672區域)的CpG島，且在Hcy干預下miR-125b的甲基化水平增強(P＜0. 01);而用AZC干預后，發現miR-125b表達上調，差異有顯著性(P＜0. 05)。結論Hcy可能通過下調miR-125b表達從而促進VSMCs增殖，可能通過上調miR-125b基因甲基化水平從而下調miR-125b表達。

關鍵詞:同型半胱氨酸; miR-125b; DNA甲基化;血管平滑肌細胞;動脈粥樣硬化;增殖網絡出版時間:2015－6－5 11:22

網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.027.html

姜怡鄧(1974－)，男，博士，教授，研究方向:心血管病理生理學，通訊作者，Tel: 0951-6980998，E-mail: jwcjyd @ 163.com

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的獨立危險因子［1］，Hcy可通過促進血管平滑肌細胞(vascular smooth musclecells，VSMCs)增殖而影響AS的發生發展［2－3］，但Hcy促進VSMCs增殖的機制尚不完全清楚。microRNA(miRNA)參與了多種細胞的增殖、凋亡、分化等過程，其中，miR-125b是動脈平滑肌細胞主要表達的miRNA之一［4］，而且在某些VSMCs增殖為特征的病變組織中miR-125b的表達與正常組織中差異存在顯著性［5］。但Hcy是否通過影響miR-125b的表達而促進VSMCs增殖未見報道。研究表明，Hcy可通過影響基因啟動子區甲基化程度而影響基因表達，因此本研究擬探討Hcy是否通過改變miR-125b基因啟動子區甲基化水平從而影響miR-125b的表達，進而促進VSMCs增殖。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器DMEM培養基、胎牛血清、胰酶(Hyclone公司);逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(Fermentas公司); TRIzol試劑(Invitrogen公司); DNA抽提試劑盒(北京百泰克); DNA甲基化修飾試劑盒(美國ZYMO RESEARCH);鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(北京中杉金橋)。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR儀(美國Eppendorf公司);電泳儀及凝膠成像系統(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1原代血管平滑肌細胞培養新鮮臍帶取自寧夏醫科大學附屬醫院產科健康足月剖腹產胎兒，取臍靜脈進行血管平滑肌細胞的原代培養。首先，將剖宮產術后胎兒的臍靜脈取下后，放入加有雙抗(100 kU·L－1青霉素、1×105g·L－1鏈霉素)的DHank's液中。剝離血管外膜及結締組織，將血管中膜部分留下，再沿著血管方向將其剪開，用棉簽輕輕擦拭上表面，將內膜拭去后將之放入另一培養皿中，滴少量DMEM(含F12)培養液，將血管條切成1 mm2的小組織塊，然后轉進培養瓶內培養。待原代細胞生長至0. 7～0. 9時，用胰酶消化傳代，選取生長良好的第3～7代細胞用于實驗。培養液為含體積分數為0. 1胎牛血清的DMEM/F-12培養基，置于37℃，飽和濕度體積分數為0. 05 CO2培養箱培養。并將細胞分為空白對照組(0 μmol·L－1Hcy)，不同濃度Hcy干預組(50、100、200及500 μmol· L－1Hcy)。

1.2.2熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-125b的表達按照試劑盒說明書提取總miRNA，之后逆轉錄為cDNA，以此為模板進行熒光定量PCR檢測miR-125b的表達; miR-125b引物序列:上游5'-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3'，下游5'-GCTGTCAACATACGCT ACGTA-3'，擴增產物78 bp;反應條件:94℃預變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35次循環。以U6為內參照，根據PCR儀自動生成的Ct值，根據公式計算目的基因的相對量:相對表達量=2－△△Ct。

1.2.3巢式降落式甲基化特異性PCR(ntMS-PCR)檢測miR-125b DNA甲基化程度根據DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，用亞硫酸鹽修飾法對DNA進行修飾，設計外引物、甲基化引物(M)及非甲基化引物(U)，miR-125b外引物上游: 5' GGATGGTGTTATAGGAGGTTGTG-3'，下游: 5'-CTCTTTCCCCCAAAACAAATATAC-3'，產物長度為445 bp; M上游: 5'-GATGGTGTTATAGGAGGTTGTGC-3'，下游: 5'-AAAAAACCAAAAAATAAAATTCGAA-3'; U上游: 5'-GATGGTGTTATAGGAGGTTGTGTG-3'，下游: 5'-AAAAAACCAAAAAATAAAATTCAAA-3'。反應條件: 94℃預變性5 min，然后采用降落式PCR程序，30個循環，再于恒定的退火溫度下進行20個循環，最后72℃再延伸10 min，甲基化產物與非甲基化產物均為117 bp，反應后取終產物，在2%瓊脂糖凝膠電泳，分析光密度，按如下公式進行結果的計算:甲基化/% = OD甲基化/(OD甲基化+ OD非甲基化)×100%。

1.2.4 MTT法檢測平滑肌細胞增殖活性0. 25%胰蛋白酶消化VSMCs，用含10%胎牛血清的完全培養基稀釋成單細胞懸液，以每孔103～104的密度接種于96孔培養板中，每孔終體積200 μL。繼續培養待細胞進入對數生長期后，將血清含量降至5%繼續培養24 h，以同步化細胞。然后以Lip2000轉染miR-125b各組分，后繼續培養48 h。每孔加入20 μL MTT試劑(PBS稀釋為質量濃度5 g·L－1)，避光培養4 h，每孔換為150 μL DMSO，在搖床上搖動15 min后，490 nm檢測波長下用酶標儀檢測各孔吸光度(optical density)，計算抑制率。抑制率/% =(1－實驗組測定值/空白對照組測定值)×100%。以時間為橫軸，細胞生長抑制率為縱軸，繪制細胞生長曲線。利用酶標儀測定各孔光吸收值，記錄并分析結果。

2　結果

2.1 Hcy對miR-125b表達的影響qRT-PCR法檢測各組VSMCs中miR-125b的表達，結果顯示，Hcy干預各組miR-125b表達下調，但并不呈劑量依賴關系，在100 μmol·L－1Hcy處作用最明顯，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0. 01)，50 μmol Hcy組差異雖無統計學意義，但有下降趨勢，見Fig 1。

Fig 1　Different concentrations of Hcy inhibited expression of miR-125b*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group

2.2 miR-125b對細胞增殖的影響利用miR-125b前體和抑制劑分別轉染VSMCs，兩者的終濃度為100 nmol·L－1。然后利用MTT法檢測細胞增殖活性。結果發現轉染pEZX-miR125b可以抑制VSMCs增殖，而轉染miR-125b inhibitor卻促進VSMCs增殖，差異均有統計學意義(P＜0.01)，見Fig 2。

Fig 2　MiR-125b infected proliferative activity of vascular smooth muscle＊＊P＜0.01 vs control group

2.3 miR-125b生物信息學分析利用生物信息學軟件CpG island searcher分析miR-125b啟動子區CpG島，選取miR-125b基因上游3 700 bp作為研究對象，發現miR-125b啟動子區含有一個長度為792bp(1881－2672區域)的CpG島，提示miR-125b基因很可能受到甲基化的調控，見Fig 3。

Fig 3　Bioformatics analysis of miR-125b

2.4 Hcy對miR-125b啟動子區甲基化程度的影響用Hcy干預的各組細胞，利用ntMS-PCR法檢測miR-125b甲基化程度變化，如Fig 4所示，不同濃度Hcy干預后，miR-125b啟動子區發生高甲基化變化，但并不呈劑量依賴關系，在100 μmol·L－1組作用最明顯，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0. 01)，見Fig 4。

Fig 4　Hcy induced change of miR-125b DNA methylation levelM: Methylated production; U: Unmethylated production.＊＊P＜0. 01 vs control.

2.5 AZC干預后miR-125b表達水平變化根據上述實驗結果，選取100 μmol·L－1Hcy干預VSMCs，在加入DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜胞苷(AZC)10 nmol·L－1后，再次檢測miR-125b表達，結果顯示AZC組與100 μmol·L－1Hcy干預組相比miR-125b表達水平升高(P＜0. 05)，提示miR-125b的表達受到甲基化的調控，見Fig 5。

Fig 5　Change of miR-125b expression after AZC intervention*P＜0. 05 vs 100 μmol·L－1Hcy group

3　討論

本研究結果顯示，Hcy可降低VSMCs的miR-125b表達; miR-125b前體可抑制VSMCs增殖，抑制miR-125則促進VSMCs增殖; Hcy干預VSMCs后miR-125b啟動子區發生高甲基化變化，而加入DNA甲基化酶抑制劑AZC后，miR-125b表達升高。

microRNA(miRNA)是一類長度只有21nt左右的內源性非編碼單鏈RNA，是近年來基因轉錄后水平調控的研究熱點。研究表明，miRNA雖然大約只占人類預測基因的3%以上，但卻調控大約30%的蛋白編碼基因，參與多種細胞的增殖、凋亡、分化等過程［6］。不同組織和細胞具有特異性的miRNAs，如miR-223在造血系統特異性表達，miR-1、miR-30c 和miR-26等在心肌細胞中特異表達［7］;而動脈血管平滑肌細胞主要表達的miRNA為miR-125b、miR-145等［4］。miR-125b不僅在不同的正常組織中表達不同，在正常組織與病理組織中的表達也存在明顯差異，如Ruirui等［5］利用基因芯片的技術，檢測了球囊損傷誘導的血管新生內膜形成模型中頸動脈microRNA的表達，發現miR-125b的含量下調。VSMCs增殖是血管新生內膜形成的關鍵分子事件［8］，提示miR-125b可能在血管功能中發揮重要作用，并可能調控VSMCs的增殖。本實驗檢測Hcy干預下的VSMCs中miR-125b的表達，發現其水平降低;而轉染miR-125b的前體(通過細胞內生物學過程表達miR-125b)或抑制劑后檢測VSMCs細胞增殖活性，發現其前體可以使細胞增殖活性下降，而其抑制劑可以使細胞增殖活性升高。綜合以上結果，提示Hcy可通過下調miR-125b的表達而促進VSMCs的增殖。

為了進一步明確Hcy下調miR-125b的表達的機制，我們檢測了miR-125b的甲基化水平。DNA甲基化是表觀遺傳范疇的重要內容之一，所謂DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶的催化下，將甲基轉移到CpG二核苷酸5'胞嘧啶的第5位碳原子上的過程［9］。DNA甲基化研究最早在腫瘤中開展，而近年關于DNA甲基化在AS中的作用越來越受到關注。在AS形成中，國內外先后報道了LDL受體等［10］的DNA甲基化改變。本課題組前期研究在人臍靜脈細胞培養的過程中加入不同濃度的Hcy培養過程中也觀察到全基因組、ApoE等基因的甲基化改變［11－12］。一般情況下，DNA的甲基化會使基因表達沉默，而去甲基化則激活基因的表達［13］。近年研究表明，DNA甲基化也可以影響miRNA的表達，如Kong等［14］研究表明，DNA甲基化可以導致miR-375表達水平改變，其高甲基化會引起miR-375下調。Hashimoto等［15］研究發現，在胃癌的組織和細胞中miRNA-181c基因出現高甲基化變化，其表達降低，且甲基化是發生在miRNA-181c基因的CpG島上，而用甲基轉移酶抑制劑5-氮雜胞苷(AZC)處理胃癌細胞可以使microRNA-181c的表達上調，并抑制胃癌細胞的生長增殖。本實驗通過生物信息學分析發現，miR-125b啟動子區存在CpG島，表明miR-125b具有受甲基化調控的結構基礎;檢測Hcy干預下的VSMCs中miR-125b甲基化水平，發現其甲基化程度上調;而我們用AZC干預后再次檢測miR-125b的表達，發現其表達上調，提示Hcy可能通過使miR-125b DNA高甲基化從而抑制其表達。

綜上所述，本研究結果表明，Hcy可能通過上調miR-125b基因甲基化水平，進而下調miR-125b表達，從而促進VSMCs增殖。這一發現為進一步揭示Hcy致AS發生發展的機制提供了新思路，為AS的防治提供了新的治療靶點。

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Role of homocysteine to promote the vascular smooth muscle cell proliferation by MiR-125b methylation

LIU Xian-mei1，CAO Cheng-jian2，TIAN Jue1，ZHAO Li2，KONG Fan-qi1，ZHOU Long-xia1，CHEN Jiu-kai2，WANG Yan-hua2，YANG Xiao-ling1，JIA Yue-xia1，JIANG Yi-deng1
(1.Preclinical Medicine College; 2.Inspection College，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China)

Abstract:Aim To investigate the role of miR-125b and its DNA methylation in homocysteine(Hcy)-induced vascular smooth muscle cells(VSMCs)proliferation.Methods VSMCs were stimulated with 0，50，100，200，500 μmol·L－1Hcy respectively.Then qRT-PCR was used to detect the mRNA levels of miR-125b，and nested-touchdown methylation-specific PCR(ntMS-PCR)was used to detect the methylation levels of miR-125b.VSMCs were transfected with miR-125b precursor or the inhibitor of miR-125b，then 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)assay was used to reflect the proliferation of VSMCs.The distribution of CpG islands of miR-125b promoter region was analyzed by bioinformatics methods.VSMCs were stimulated with 100 μmol·L－1Hcy and transfected with or without DNA methylation inhibitors 5-nitrogen impurity cytidine(AZC)，then the expression of miR-125b was detected by qRT-PCR.Results The mRNA levels of miR-125b were decreased in 100，200，500 μmol·L－1Hcy group compared with 0 μmol·L－1Hcy group.The precursor of miR-125b could inhibit the proliferation activity and the inhibitor of miR-125b could increase the proliferation activity of VSMCs cells.Bioinformatics analysis indicated that MiR-125b promoter region had a CpG island whose length was 792 bp(1881-2672).The miR-125b promoter region methylation levels increased after Hcy intervention(P＜0. 01).The expression level of miR-125b increased after AZC intervention(P＜0. 05).

Conclusions①Hcy promotes vascular smooth muscle cell proliferation maybe by down-regulating the expression of miR-125b.②Hcy down-regulates the expression of miR-125 maybe by up-regulating the methylation levels of miR-125b promoter region.

Key words:homocysteine; miR-125b; DNA methylation; vascular smooth muscle cell; atherosclerosis; proliferation

作者簡介:劉現梅(1986－)，女，碩士生，研究方向:動脈粥樣硬化病理生理學，E-mail: meiziliu1413@163.com;

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81360027，81360052，81360053)

收稿日期:2015－01－05，修回日期:2015－03－02

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－1023－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.027