多聚賴氨酸與EDTA交聯物對小鼠成纖維細胞的毒性研究*

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多聚賴氨酸與EDTA交聯物對小鼠成纖維細胞的毒性研究*

**通信作者 E-mail:jiany110@sina.com

網絡出版時間：2015-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.50 12.R.20150420.1929.028.html

李英琦， 張海燕**

(貴陽醫學院附院 眼科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察多聚賴氨酸與乙二胺四乙酸(EDTA)的交聯物(PLE)對體外培養的小鼠成纖維細胞 L929的毒性程度。方法： 小鼠成纖維細胞L929分為正常組、對照組、多聚賴氨酸組、PLE組和EDTA組，采用MTT法比較相同濃度下，EDTA、多聚賴氨酸與EDTA交聯物對小鼠成纖維細胞L929相對增殖率的影響。結果： 以正常組作為標準(100%)，多聚賴氨酸組、EDTA組、PLE組和對照組對小鼠成纖維細胞L929的相對增殖度(RGR) 分別為 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均較正常組下降，差異有統計學意義(P<0.05)；在質量濃度達為1 000 μmoL/L時，EDTA對小鼠成纖維細胞L929的毒性為2級，PLE和多聚賴氨酸對小鼠成纖維細胞L929的毒性為1級。結論： 實驗濃度的PLE和EDTA對小鼠成纖維細胞 L929毒性較低，具有一定的安全性。

[關鍵詞]多聚賴氨酸； 乙二胺四乙酸； 成纖維細胞； 細胞毒性

白內障是世界范圍內主要的致盲眼病之一，隨著我國人口的老齡化，有學者預計在2020年我國50歲及以上人群的患病比例約為25%。目前治療白內障的唯一有效的方法就是通過手術來恢復視覺功能，但術后的后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO) 是最常見并發癥。PCO的出現亦可能引起患者再次發生視力障礙(又稱后發性白內障)。現代白內障手術保留了囊袋， 囊袋由部分前囊和整個后囊組成， 起到隔離房水和玻璃體的作用，大部分囊袋內放置了人工晶狀體。白內障術后剩余前囊膜的晶狀體上皮細胞會頑固地殘留，這些殘留的晶狀體上細胞(1ens cells，LEC)黏附、增殖、移行，導致后囊epithelial混濁。LEC需要黏附才能正常生長，細胞黏附的破壞可以致細胞凋亡。整合素是一類ca2+依賴的介導細胞間或細胞與基質間相互作用的黏附分子，維持正常細胞內外信號傳導，其與細凋亡的關系密切。劉建亭研究發現，EDTA可破壞細胞間連接，減輕后囊膜混濁。張海燕等研究發現聚賴氨酸與乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetracetic acid,EDTA)的交聯物(polylysine-EDTA,PLE)可顯著降低兔PCO的發生率。本實驗在體外培養的小鼠成纖維細胞 L929中加入PLE,觀察其對細胞的毒性作用。

1材料和方法

1．1　材料

DMEM/1640(美國Sigma公司)， PBS片溶劑(美國Sigma公司)， 胰蛋白酶(美國Solarbio公司)，RPMI-1640培養基(美國GIBCO公司)， MTT(美國Solarbio公司)， EDTA(美國Sigma公司)，DMSO(重慶川東化工)，多聚賴氨酸( Poly-L-Lysine， 美國Sigma公司)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，湖南湘中地質實驗研究所)。Olympus倒置顯微鏡CKX-41(日本，Olympus)，板式酶標儀ZS-2(北京，新風機電)，二氧化碳培養箱MCO-175(日本，三洋)，超凈工作臺BHC-1300(蘇洲，安泰)。

1．2　方法

1.2.1實驗分組小鼠成纖維細胞L929，購于第四軍醫大學實驗動物中心，成纖維細胞分5組：正常組，加入1 000 μmoL/L的 DMSO細胞培養液；對照組，加入含1 000 μmoL/L的二甲基亞砜培養液；多聚賴氨酸組，加入含1 000 μmoL/L的多聚賴氨酸培養液；PLE組，加入1 000 μmoL/L的PLE培養液；EDTA組，加入1 000 μmoL/L的EDTA培養液。

1.2.2試驗步驟參照使用說明書，利用EDC將EDTA與多聚賴氨酸結合起來，將所得PLE 40 mL (含2.687 mmoL/L EDTA) 放入冷凍干燥機中濃縮， 加蒸餾水至100.748 mL (含1 000μmol/L EDTA)，同時用5.6% NaHCO3調pH值至7。參照GB/T16886.5-ISO10993-5，將處于對數生長期的小鼠成纖維細胞L929 用質量濃度為2.5 g/L 的胰蛋白酶進行消化，制成終濃度為5×107/L 的細胞懸液，接種于96 孔培養板中，每孔100 μL。待細胞生長至亞融合狀態時進行試驗。于37 ℃、體積分數5% CO2環境下培養48 h后終止培養，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，而后每孔加入新配制的5 g/L MTT液20 μL，繼續培養4 h后，棄去孔中上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL溶解甲瓚沉淀，用微型超聲振蕩器震蕩搖勻 10 min，使紫色培結晶充分溶解，在酶標儀上于490 nm波長下測定吸光值。

1.3　觀察指標

根據測定的吸光值按下式計算相對增殖度(RGR)，并按表1的毒性分級標準對試驗結果進行評估。RGR%=A試驗組/A正常組×100%。

表1　毒性分級標準

1.4　統計學處理

試驗數據采用用平均值±標準差表示。應用SPSS 13.0統計軟件，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1　成纖維細胞的相對增殖度

由表2可知，以正常組作為標準(100%)，多聚賴氨酸組、EDTA組、PLE組、對照組對小鼠成纖維細胞L929 的相對增殖度(RGR) 分別為 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均較正常組下降，差異有統計學意義(P<0.05)；多聚賴氨酸組、EDTA組、PLE組RGR值與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；多聚賴氨酸組、PLE組之間RGR值比較無統計學意義(P<0.05)。

2.2　各試驗組對成纖維細胞的毒性

EDTA對小鼠成纖維細胞 L929的毒性為2級，PLE和多聚賴氨酸對小鼠成纖維細胞 L929的毒性為1級。見表2。

3討論

后發性白內障是因術后殘留的前囊膜下及赤道部晶體上皮細胞，增殖轉化為纖維細胞，并沿后囊膜遷徙，使晶狀體后囊出現混濁。利用藥物和免疫方法，抑制晶狀體上皮細胞的增殖和纖維化反應，是預防后發性白內障研究中的熱點。EDTA是一種常用的Ca2+螯合劑，它在水中溶解度高，不易透過細胞膜，相對無毒，分子量372道爾頓；在體外實驗中常用于分離上皮細胞與基底膜。利用EDTA分散組織細胞的特性， Humphry等和 Nishi等實驗證實，EDTA能夠很好地松解晶狀體上皮細胞；Bretton等[10]研究發現多聚賴氨酸可選擇性地與晶狀體囊膜結合；楊金玲等[11]將EDTA與多聚賴氨酸交聯后特異性作用于晶狀體囊，以達到有效地清除晶狀體上皮細胞的目的。

表2　各實驗組小鼠成纖維細胞L929

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與陽性對照組比較，P<0.01

細胞毒性試驗大大減少了實驗動物的使用量、測試時間較短、靈敏度較高、重現性較好，可以用于藥物安全性的快速篩查和初步篩查。目前國內外一般使用MTT法和形態學觀察法對藥物的細胞毒性進行分析[12]。形態學觀察法檢測藥物毒性最為常用，在顯微鏡下逐日觀察細胞形態變化，藥物濃度高對細胞有毒性時細胞會變圓、固縮性壞死和脫落，但此法主觀性強，結果可靠性不高。目前MTT3(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]比色法在體外腫瘤細胞化療藥敏試驗的應用越來越廣泛，成為評價藥物安全的重要指標，檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO) 能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在一定波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量，此法優點是靈敏度高、經濟。本試驗分別采用MTT法，分析測定結果以評價PLE對小鼠成纖維細胞 L929 的毒性，結果顯示，以正常組作為標準(100%)，多聚賴氨酸組、EDTA組、PLE組和對照組對小鼠成纖維細胞L929 的相對增殖度(RGR) 分別為 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均較正常組下降，差異有統計學意義(P<0.05)；在質量濃度達為1 000 umoL·L-1時，EDTA對小鼠成纖維細胞 L929的毒性為2級，PLE和多聚賴氨酸對小鼠成纖維細胞 L929的毒性為1級。

本研究實驗結果表明，PLE對細胞的生長增殖表現出良好的細胞相容性，其細胞相對增殖率較高而細胞毒性較低，具有一定的安全性。

4參考文獻

[1] 婁尚.我國老年性白內障流行病學的調查研究.南昌大學學報：醫學版, 2012(6):98-99,101.

[2] Awasthi N，Guo S，wagner BJ.Posterior capsular opacification:a problem reduced but not yet eradicated， 2009(4).

[3] 劉建亭,張素華,錢軍,等.依地酸二鈉預防兔后發性白內障的實驗研究.眼視光學雜志， 2009(1)：38-39.

[4] 張海燕,李英琦,張蘇炯,等.多聚賴氨酸-乙二胺四乙酸交聯物抑制兔晶狀體上皮細胞生長的研究.中華實驗眼科雜志, 2011(9):831-833.

[5] 《醫療器械生物學評價》GB/T16886.1-2002.

[6] Marcantonio JM, Vrensen GF. Cell biology of posterior capsular opacification. Eye (Lond)， 1999(Pt 3b):484.

[7] Goncalves C，Dinis T，Batista MT. Antionxidant properties of proanthocyanidins of Uncaria to mentosa bark decoction:a mechanism for anti-inflammatory activity. Phytochemistry, 2005(1):89-98.

[8] Humphry RC, Davies EG, Jacob TJ,et al.The human anterior lenscapsule an attempted chemical debridement of epithelial cells by ethylenediam inetetraceticacid(EDTA) and trypsin. Br J Ophthalmol, 1998(6):406-408.

[9] Nishi O, Nishi K, Hikida M. Removal of lens epithelial cells following loosening of the junctionnal compex . J Cataract Refract Surg, 1993(1):56-61.

[10]Bretton RH, Swearingen A. Use of a polylysine-saprin conjugate to prevent posterior capsule opacification. J Cataract Refract Surg, 1999(7):921-929.

[11]楊金玲,張海燕,張蘇炯,等.多聚賴氨酸與EDTA的交聯物防治兔眼后囊膜混濁的研究.眼科研究, 2008(26):893-896.

[12]徐愛風,方玉,侯本祥.天然生物膜的細胞毒性的實驗研究.北京口腔醫學, 2004(1):30-31.

(2014-10-18收稿，2015-02-14修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

Toxicity Study of Conjugates of PLL and EDTA on Mouse Fibroblast

LI Yingqi， ZHANG Haiyan

(OphthalmologyCenter,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the toxicity degree of PLE from EDTA and Poly-L-Lysine (PLL) on fibroblast L929 of mouse in vitro culture. Methods: Mouse fibroblast L929 were divided into normal group, control group, PLL group, PLE group and EDTA group, adopting MTT method to compare the effect of EDTA and PLE on proliferation of mouse fibroblast L929 under the same concentration. Results: Taking normal group as standard (100%), relative growth rate (RGR) of L929 in PLL group, EDTA group, PLE group and control group were 79.87%、69.35%、81.47% and 20.12%, lowered than normal group, differences were statistically significant (P<0.05). As the mass concentration reached 1 000 μmoL/L, toxicity of EDTA on fibroblast L929 reached level 2, PLE group reached level 1. Conclusions: Experiment concentration PLE and EDTA has minor toxicity on mouse fibroblast L929.

[Key words]poly-L-Lysine; ethylene diamine tetracetic acid; fibroblasts; cytotoxicity

[中圖分類號]R776.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)04-0360-03

*[基金項目]貴州省科技廳攻關項目[黔科合OZ字(20092)]