倪挺：探索基因調(diào)控之復(fù)雜

本刊記者　徐芳芳

倪挺：探索基因調(diào)控之復(fù)雜

本刊記者徐芳芳

基因在肉眼看不到的世界里演繹著生命的繁衍、細(xì)胞分裂和蛋白質(zhì)合成等重要生理過(guò)程，100多年來(lái)，科學(xué)家們通過(guò)解讀基因儲(chǔ)存的生命遺傳信息，逐漸揭開(kāi)了人類生命活動(dòng)基本過(guò)程的面紗。

專家簡(jiǎn)介：

倪挺，1977年生于江蘇省啟東市，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師。主要借助高通量測(cè)序技術(shù)及現(xiàn)代分子生物學(xué)等手段研究真核生物轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性以及細(xì)胞衰老基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。在Nature、Nature Methods、PNAS、PLoS Pathogens、Scientific Reports等國(guó)際期刊發(fā)表20余篇研究論文，獲7項(xiàng)授權(quán)中國(guó)專利。入選中組部第三批“青年千人”計(jì)劃和上海市“浦江人才計(jì)劃”。擔(dān)任國(guó)家科技部“973計(jì)劃”課題負(fù)責(zé)人和科技部重大科學(xué)研究計(jì)劃研究骨干，主持兩項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，是國(guó)家自然科學(xué)基金委創(chuàng)新研究群體的研究骨干。

從1909年丹麥遺傳學(xué)家約翰遜在《精密遺傳學(xué)原理》一書中正式提出“基因”概念，以此來(lái)替代孟德?tīng)柤俣ǖ摹斑z傳因子”。“基因”一詞便伴隨著遺傳學(xué)發(fā)展至今。

在神奇的生命世界里，科學(xué)家們尋找到這樣一條所有細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物都遵循的“中心法則”，即遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄從DNA（脫氧核糖核酸）到RNA（核糖核酸），再通過(guò)翻譯從RNA到蛋白質(zhì)。

圍繞這一“中心法則”，許多科學(xué)家對(duì)生命體的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了深入的探尋，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倪挺研究員就是其中一員。近年來(lái)，倪挺因在基因表達(dá)最重要的調(diào)控手段之一——中心法則中的“轉(zhuǎn)錄”和衰老相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性等方面有了新的進(jìn)展，在國(guó)際上受到了廣泛認(rèn)可。

生命科學(xué)之“夢(mèng)”

“通過(guò)揭示和研究真核生物轉(zhuǎn)錄組的多樣性，了解高等生物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為深入理解人類疾病的復(fù)雜性提供理論依據(jù)。”這是倪挺從事生命科學(xué)研究以來(lái)一直堅(jiān)持的夢(mèng)想。朝著這一目標(biāo)，他用自己對(duì)生命科學(xué)的熱情一路求索、追尋，留下了精彩的足跡。

愛(ài)因斯坦說(shuō)，興趣是最好的老師。倪挺也說(shuō)：“他和基因?qū)W有緣。”從小他就對(duì)生命世界充滿了好奇，探索和求知的欲望使他慢慢推開(kāi)了生命科學(xué)的大門。那時(shí)的他還不知道，門外，就是他的夢(mèng)想。

1996年，倪挺以優(yōu)異的成績(jī)考入北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)及分子生物學(xué)系。未名湖畔，博雅塔下，恰同學(xué)少年，風(fēng)華正茂，在濃厚的學(xué)習(xí)氛圍的熏陶下，他開(kāi)啟了生命科學(xué)之旅。從生物化學(xué)及分子生物學(xué)系學(xué)士學(xué)位到碩博連讀植物學(xué)博士學(xué)位，10年的寒窗苦讀，執(zhí)著于夢(mèng)想的他從未在探索生命科學(xué)領(lǐng)域的道路上停止過(guò)。

在生命科學(xué)植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域耕耘的林忠平教授的耐心指導(dǎo)下，倪挺對(duì)生命科學(xué)的理解逐漸由表及里，由淺入深。除了逐漸牢固生物研究基礎(chǔ)知識(shí)之外，他開(kāi)始在研究方法、研究手段上有所精進(jìn)，形成了自有的研究哲學(xué)和風(fēng)格。

在碩博連讀期間，他就建立了中國(guó)第一個(gè)食物及花粉過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ambl.pku.edu.cn），被農(nóng)業(yè)部指定為轉(zhuǎn)基因食品安全過(guò)敏性評(píng)估專業(yè)機(jī)構(gòu)，獲得了北京大學(xué)最具份量的創(chuàng)新獎(jiǎng)。同時(shí)，他還利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了高表達(dá)小胰島素原類似物的轉(zhuǎn)基因靈芝，并證實(shí)口服轉(zhuǎn)基因靈芝可以顯著降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的高血糖，研究成果對(duì)于口服胰島素的應(yīng)用具有重要意義。

“科學(xué)探索永無(wú)止盡”，對(duì)倪挺來(lái)說(shuō)更是如此。在北京大學(xué)博士畢業(yè)以后，他懷抱進(jìn)一步深造的夢(mèng)想，馬不停蹄地跨出國(guó)門，開(kāi)啟了學(xué)術(shù)研究上的另一段重要征程。2007年～2010年進(jìn)入美國(guó)杜克大學(xué)基因組科學(xué)與政策研究所在朱鈞教授實(shí)驗(yàn)室從事博士后研究，2010年～2012年在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）擔(dān)任助理研究員。

5年的海外漂泊使倪挺有機(jī)會(huì)領(lǐng)略了國(guó)際最前沿的科研理念，煉就了洞察生命科學(xué)國(guó)際走向的“火眼金睛”。2012年，在國(guó)家緊缺創(chuàng)新型人才的時(shí)候，“羽翼豐滿”的倪挺借第三批“青年千人計(jì)劃”的“東風(fēng)”回到了祖國(guó)，受聘為復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員。

“我們要把人生變成一個(gè)科學(xué)的夢(mèng)，然后，再把夢(mèng)變成現(xiàn)實(shí)。”居里夫人說(shuō)過(guò)的這句話用來(lái)形容倪挺再適用不過(guò)，他也希望有“夢(mèng)照現(xiàn)實(shí)”的一天。不管前面的路是平坦還是布滿荊棘，只要選擇了遠(yuǎn)方，便只顧風(fēng)雨兼程。正因?yàn)閷?duì)生命科學(xué)的這份熱情與執(zhí)著，他收獲了科研上的累累碩果。

三項(xiàng)技術(shù)探秘基因表達(dá)調(diào)控

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)于轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識(shí)也不斷加深，許多新的剪接異構(gòu)體、非編碼RNA以及新的調(diào)控方式不斷被發(fā)現(xiàn)，組成了一個(gè)神奇的RNA世界，也成為了一個(gè)新興的熱門領(lǐng)域。

在朱鈞博士實(shí)驗(yàn)室，倪挺就接受了嚴(yán)格的現(xiàn)代分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及基因組實(shí)驗(yàn)技術(shù)的訓(xùn)練，并且發(fā)展了新的多個(gè)基因組及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法。他采用“分子條形碼技術(shù)”，使得新一代測(cè)序技術(shù)中最具挑戰(zhàn)性的序列較短的問(wèn)題得以解決。該方法同時(shí)還能應(yīng)用于白血病相關(guān)致病基因的早期低豐度突變的靈敏檢測(cè)，目前，已申請(qǐng)了美國(guó)發(fā)明專利。

轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)關(guān)鍵的第一步。倪挺針對(duì)轉(zhuǎn)錄的三個(gè)環(huán)節(jié)，開(kāi)發(fā)了三種新的高通量測(cè)序方法，這三項(xiàng)成果成為其研究生涯中的三大亮點(diǎn)。

針對(duì)轉(zhuǎn)錄起始環(huán)節(jié)，倪挺開(kāi)發(fā)了雙端測(cè)序方法，并首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)三種轉(zhuǎn)錄起始模式，建立了其與啟動(dòng)子核心元件及表觀遺傳標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性，從而豐富了對(duì)轉(zhuǎn)錄起始模式的認(rèn)識(shí)。該技術(shù)同時(shí)為mRNA重新加帽（recapping）這一新現(xiàn)象提供了最為有力的證據(jù)，證明其廣泛存在于轉(zhuǎn)錄組中。由于這一工作的重要性，Nature Reviews Genetics在論述轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性時(shí)還特別引用了他們的這一發(fā)現(xiàn)。

雙端測(cè)序確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的方法發(fā)表于《Nature Methods》并被列為封面推薦。《Nature Methods》還以NEWS and VIEWS形式對(duì)倪挺的方法以及稍后時(shí)間發(fā)表的另一個(gè)相關(guān)方法進(jìn)行了深度評(píng)述，并認(rèn)為他們建立的方法極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)研究。

隨后，《Nature Reviews Genetics》 RNA富集在減數(shù)分裂和對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)答的基因中，從而拓展了反義RNA新的生物學(xué)功能，豐富了人們對(duì)于真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)。

這是首次在單細(xì)胞生物中發(fā)現(xiàn)反義RNA參與了減數(shù)分裂這一與酵母生殖密切相關(guān)的重要過(guò)程。這一重要發(fā)現(xiàn)被隨后的Science封面文章多次引用并加以證實(shí)。同時(shí)，該方法已被國(guó)內(nèi)外10多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用并取得了很有意思的發(fā)現(xiàn)。

針對(duì)轉(zhuǎn)錄終止環(huán)節(jié)過(guò)程，倪挺建立了多聚腺苷酸精確定位測(cè)序方法（PA-seq）。這一方法的建立完善了對(duì)于轉(zhuǎn)錄過(guò)程從頭到尾的研究，為研究選擇性將他的這個(gè)方法作為RNA測(cè)序領(lǐng)域的一種重要方法給予介紹。論文同時(shí)被“基因組在線”這個(gè)在基因組研究領(lǐng)域具有重要影響力的網(wǎng)站在This week in Nature專欄中作為Nature Methods的唯一入選論文加以報(bào)道。這一方法同時(shí)也被介紹下一代測(cè)序技術(shù)的專著引用。關(guān)于轉(zhuǎn)錄起始模式和表觀遺傳學(xué)標(biāo)記關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)也被Nature Reviews Genetics作為重要文獻(xiàn)引用。

為了更好地從全基因組水平研究轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控，倪挺開(kāi)發(fā)了定向連接介導(dǎo)的鏈特異性RNA-seq方法。利用這個(gè)方法，他首次在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)反義多聚腺苷酸化在基因調(diào)控中的重要作用提供了技術(shù)支撐。利用這個(gè)方法，他們測(cè)定了多個(gè)人體組織的polyA加尾位點(diǎn)，并取得了兩個(gè)很有意思的發(fā)現(xiàn)。其一，選擇性polyA加尾不僅在編碼基因中存在，在非編碼基因中也廣泛存在；其二，發(fā)現(xiàn)了一組對(duì)人組織特異性具有調(diào)控作用的選擇性Poly（A）新位點(diǎn)。

三項(xiàng)技術(shù)成果的組合使用對(duì)于全面理解和揭示真核生物轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性，了解高等生物基因調(diào)控奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，為深入理解人類疾病的復(fù)雜性提供了全新手段。

研發(fā)線粒體DNA低頻突變深度測(cè)序方法

近10年來(lái)，衰老相關(guān)疾病顯著增加，而且一些疾病逐漸呈年輕化發(fā)展。衰老是一個(gè)漸進(jìn)的緩慢過(guò)程，其必然包括某些基因成千上萬(wàn)個(gè)拷貝的漸進(jìn)性序列改變，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，只有線粒體這個(gè)遺傳系統(tǒng)有上千拷貝，從0～100％漸進(jìn)的遺傳變異。

線粒體DNA（mtDNA）是母系遺傳，并有較大的遺傳變異，這些遺傳變異是使得人類能夠適應(yīng)環(huán)境改變的一個(gè)重要因素。每個(gè)細(xì)胞含有百計(jì)的線粒體和千計(jì)的線粒體DNA（mtDNA），研究表明，線粒體功能衰退和mtDNA的損傷被認(rèn)為在衰老及其相關(guān)疾病中起著重要的作用，也和諸多疾病，如耳聾、心臟病、腎病等退行性疾病有關(guān)系。近幾十年來(lái)，研究者們提出各種衰老假說(shuō)，并不斷聚焦于線粒體。隨著mtDNA分子生物學(xué)研究的深入，mtDNA在疾病中的作用逐漸為人們所重視。

在以前的研究中，由于檢測(cè)技術(shù)的限制，多數(shù)研究關(guān)注與mtDNA的缺失突變和高頻點(diǎn)突變導(dǎo)致的生物學(xué)后果，而對(duì)低頻點(diǎn)突變導(dǎo)致衰老及相關(guān)疾病的研究不足，特別是總體而言，mtDNA突變到什么程度才能引起衰老更是知之寥寥。

回答mtDNA突變（特別是低頻點(diǎn)突變）與衰老研究中的未解之謎，可靠測(cè)定線粒體低頻點(diǎn)突變的技術(shù)是前提。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，測(cè)序的深度和覆蓋度不斷加深，使得之前所不能實(shí)現(xiàn)的低頻點(diǎn)突變檢測(cè)有了可能。

然而，近幾年出現(xiàn)的基于深度測(cè)序來(lái)測(cè)定線粒體突變的方法都存在一定的局限性：從細(xì)胞中分離線粒體，再提取線粒體DNA并構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行深度測(cè)序的方法涉及到線粒體的分離，操作復(fù)雜繁瑣，工作量大；基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增的深度測(cè)序方法覆蓋度均一性較差，易于引入低頻突變，干擾真正低頻突變的檢測(cè)；序列捕獲方法不能有效區(qū)分來(lái)自核基因組的線粒體假基因。

為了克服以上方法的缺點(diǎn)，倪挺及其科研團(tuán)隊(duì)研發(fā)出了一種更簡(jiǎn)單、更高效的線粒體DNA低頻突變深度測(cè)序方法。這種方法通過(guò)設(shè)計(jì)一組線粒體DNA特異的引物，采用滾環(huán)復(fù)制（RCA）從總DNA中富集線粒體DNA，并通過(guò)特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步富集線粒體DNA，然后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序，并開(kāi)發(fā)特定的數(shù)據(jù)分析流程，從而達(dá)到測(cè)定線粒體基因組中低頻率變異的目的。

RCA比PCR保真性大大增強(qiáng)，酶切過(guò)程克服了核基因組線粒體假基因的干擾。這兩方面的優(yōu)勢(shì)使得倪挺研發(fā)的新技術(shù)能夠可靠檢測(cè)低至0.3％的mtDNA低頻點(diǎn)突變。這一精度足夠倪挺所在的科研團(tuán)隊(duì)檢測(cè)頻率＜2％的點(diǎn)突變，因此突破了技術(shù)限制，為解決mtDNA低頻突變與衰老研究之間的關(guān)系提供了新的可能。

基于這一檢測(cè)方法，倪挺及團(tuán)隊(duì)在線粒體DNA聚合酶g（Polg）基因突變導(dǎo)致mtDNA復(fù)制修復(fù)功能缺失的小鼠中進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)突變小鼠的mtDNA低頻點(diǎn)突變顯著高于野生型小鼠，并發(fā)現(xiàn)不同組織具有不同數(shù)目的低頻點(diǎn)突變，mtDNA聚合酶（Plog）基因突變導(dǎo)致早衰的小鼠中mtDNA突變水平的升高主要是由于低頻點(diǎn)突變的位點(diǎn)數(shù)目增加，而已有突變位點(diǎn)的頻率增加則居次要地位。更有意思的是，Polg基因突變小鼠中有更多的胞嘧啶（C）變成胸腺嘧啶（T），使得更多親水氨基酸變成疏水性，提示低頻點(diǎn)突變的累積可能是導(dǎo)致早衰表型的原因。

在科研的不斷深入的同時(shí)，倪挺帶領(lǐng)科研團(tuán)隊(duì)申請(qǐng)到了國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，在接下來(lái)的研究中，他將以“線粒體DNA低頻點(diǎn)突變?cè)谒ダ现械挠绊懠皺C(jī)制”為研究重點(diǎn)，利用自主開(kāi)發(fā)的線粒體DNA低頻點(diǎn)突變檢測(cè)新方法，以具有早衰表型的小鼠和正常衰老的小鼠為研究對(duì)象，結(jié)合最新的基因編輯技術(shù)（實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)突變）、鏈特異性RNA-seq技術(shù)（研究線粒體DNA低頻點(diǎn)突變的基因表達(dá)）以及其他必要的分子生物學(xué)手段，闡明線粒體DNA低頻點(diǎn)突變?cè)诓煌ダ项愋椭须S衰老進(jìn)程的變化規(guī)律以及mtDNA在不同組織具有不同突變頻率/速度的內(nèi)在機(jī)制。

目前，為了能夠深入研究這一課題，倪挺組織力量進(jìn)一步加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)的結(jié)合，解讀線粒體基因及核基因組所攜帶的遺傳信息傳遞過(guò)程，探索生命這個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)的奧秘。與此同時(shí)，他也一直在為煉就一支精于科研的團(tuán)隊(duì)，為生命科學(xué)培養(yǎng)出更多的精英，研發(fā)新技術(shù)而忙碌。

對(duì)于未來(lái)的規(guī)劃，倪挺心中已再清晰不過(guò)了。站在黃浦江畔，立身于復(fù)旦這所在學(xué)術(shù)研究上享譽(yù)全球的巍巍大學(xué)，倪挺用科研成果詮釋著自己對(duì)生命科學(xué)的熱情與執(zhí)著。