同型半胱氨酸對(duì)小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞毒性作用研究

茍 蕓，黃國(guó)偉，陳 爽，張緒梅

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津300070）

論著

同型半胱氨酸對(duì)小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞毒性作用研究

茍 蕓，黃國(guó)偉，陳 爽，張緒梅

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津300070）

目的：研究同型半胱氨酸（Hcy）對(duì)小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞（N2a）毒性作用并探討其對(duì)pERK1/2蛋白表達(dá)的影響。方法：培養(yǎng)的N2a細(xì)胞加入不同濃度Hcy，隨機(jī)分為4組：分別為正常對(duì)照組及Hcy低、Hcy中、Hcy高濃度組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定以上4組Hcy干預(yù)濃度分別為0、30、300和1 000μmol/L。作用72 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)N2a細(xì)胞pERK1/2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，Hcy低、中、高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.013、0.008和0.011，P<0.05）。低、中、高濃度Hcy作用后，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力下降，OD值降低，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.01、0.006和0.009，P<0.05）。各Hcy干預(yù)組pERK1/2蛋白表達(dá)量降低，且中、高濃度Hcy組pERK1/2蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.038、0.007，P<0.05）。結(jié)論：Hcy能抑制磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)，從而對(duì)N2a產(chǎn)生毒性作用，進(jìn)而抑制N2a增殖，提示降低血清中Hcy水平可以對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

同型半胱氨酸；小鼠；成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a；細(xì)胞凋亡；pERK1/2

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種體內(nèi)不能自行合成的含硫四碳氨基酸，也是蛋氨酸和半胱氨酸重要的中間代謝產(chǎn)物。流行病學(xué)研究顯示，血漿中Hcy水平升高是阿爾茲海默癥、血管性癡呆、帕金森病和中風(fēng)等神經(jīng)退行性疾病的危險(xiǎn)因素之一[1-2]。此外，有研究報(bào)道，母體內(nèi)Hcy濃度升高可以導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管畸形[3]。Hcy可增加血腦屏障的通透性導(dǎo)致大腦對(duì)Hcy的暴露，發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用[4]。有關(guān)Hcy如何損傷神經(jīng)系統(tǒng)，以及引發(fā)神經(jīng)退行性病變的具體機(jī)制尚不清楚。目前研究認(rèn)為，Hcy發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的機(jī)制較為復(fù)雜，可能與N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體過度激活、氧化應(yīng)激損傷及低甲基化等有關(guān)[5-7]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（external-signal regulated kinase, ERK）1/2是介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的一種重要信號(hào)蛋白分子，但目前有關(guān)ERK1/2如何介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的損傷少有報(bào)道。小鼠N2a成神經(jīng)瘤細(xì)胞系是一種來源于腦組織的細(xì)胞系，是進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)研究的重要細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)以N2a細(xì)胞為受體細(xì)胞，研究Hcy是否通過調(diào)控pERK蛋白表達(dá)發(fā)揮其毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料 同型半胱氨酸（H4628）購(gòu)于Sigma公司；DMEM（#10569）購(gòu)于Gibco公司；兔抗大鼠多克隆一抗ERK1/2（#4695）、pERK1/2（#4370）購(gòu)自Cell Signaling公司；BCA蛋白試劑盒（AR1046）購(gòu)于博士德公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（IH-0011）購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（WBKIS0100）購(gòu)于Merck Millipore公司；乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒（A020-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a（目錄號(hào)：TCM29）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 N2a細(xì)胞培養(yǎng) N2a細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)。將細(xì)胞接種于直徑60mm培養(yǎng)皿置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁，濃度約為5×106，將其分為4組：正常對(duì)照組、Hcy低、Hcy中、Hcy高濃度組，以上4組Hcy干預(yù)濃度分別為0、30、300、1 000 μmol/L。作用72 h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2 以LDH試劑盒檢測(cè)LDH活性 收集72 h各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按試劑盒說明書操作。于96孔板中分別加入相應(yīng)的試劑，混勻，室溫放置5min，于波長(zhǎng)450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。LDH活性（U/L）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×1 000，計(jì)算LDH活性。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，接種于96孔板，每組8個(gè)復(fù)孔，每孔200μL，同時(shí)做空白對(duì)照。分別于24、48、72、96 h后每孔加MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解后，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度（OD）值。

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中pERK和ERK蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞后用PBS洗兩次，800 r/min離心3 min，棄上清。加150μL裂解液后超聲3次（20Hz，每次10 s，間隔10 s）。16 000×g，4℃離心15min，取上清液。細(xì)胞中蛋白濃度用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)。將等量蛋白（約30μg）在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉(zhuǎn)NC膜。將膜分別放在含p-ER K（1∶2 000）和ER K（1∶2 000）的抗體中4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，用化學(xué)發(fā)光底物試劑顯色。蛋白條帶用ImageJ2.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)數(shù)資料結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以±s表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 光鏡下可見，正常N2a細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈圓形或豆?fàn)睿負(fù)沓蓤F(tuán)，邊緣光滑，折光性較強(qiáng)，個(gè)別細(xì)胞有軸突。與對(duì)照組相比，各Hcy干預(yù)組細(xì)胞量減少，單個(gè)散在細(xì)胞增多；細(xì)胞不易“抱團(tuán)”且出現(xiàn)細(xì)胞碎片，Hcy高濃度組尤其明顯（圖1），提示Hcy可導(dǎo)致N2a細(xì)胞明顯損傷。

圖1 N2a細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×100）Fig 1 M orphologic observation of N2a cells(×100)

2.2 Hcy對(duì)N2a細(xì)胞的毒性作用 細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低、中、高濃度Hcy干預(yù)組的LDH活性均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明Hcy造成細(xì)胞損傷，膜通透性增高，且在一定濃度范圍內(nèi)，Hcy的毒性作用呈濃度依賴性。見表1。

表1 不同濃度Hcy對(duì)N2a細(xì)胞LDH活性的影響（n=3，±s）Tab 1 Theneurotoxicity of Hcy on N2a cells（n=3，±s）

表1 不同濃度Hcy對(duì)N2a細(xì)胞LDH活性的影響（n=3，±s）Tab 1 Theneurotoxicity of Hcy on N2a cells（n=3，±s）

與正常對(duì)照組比較aP<0.05；與Hcy低濃度組比較bP<0.05；與Hcy中濃度組比較cP<0.05

組別 LDH活性/（U／L）正常對(duì)照組 23.15±3.18 Hcy低濃度組 29.52±1.82aHcy中濃度組 33.66±3.76abHcy高濃度組 40.50±1.91abc

2.3 Hcy對(duì)各組N2a細(xì)胞增殖的影響 在干預(yù)48、72和96 h后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Hcy低、中、高各濃度組的OD值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且Hcy濃度越高，OD值越低，說明其抑制N2a增殖的效果越明顯，見圖2。

與正常對(duì)照組比較aP<0.05

2.4 pERK1/2蛋白的表達(dá) Western blot分析各組pERK1/2蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，中、高濃度Hcy作用組pERK蛋白表達(dá)量低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另外，與Hcy低濃度組比較，Hcy高濃度組pERK蛋白表達(dá)量亦顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 Hcy對(duì)pERK 1/2蛋白表達(dá)的影響Fig 3 TheHcy effectson thep rotein expression of pERK 1/2

3 討論

正常人體內(nèi)血漿中Hcy濃度為5～15μmol/L[8]，遺傳因素引起Hcy代謝相關(guān)的亞甲基四氫葉酸還原酶、胱硫醚-β-合成酶缺乏或活性降低，或某些營(yíng)養(yǎng)素缺乏（如葉酸、維生素B6、B12缺乏）均可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinaemia,HHcy）[9]。研究表明高同型半胱氨酸能顯著提高在體和離體培養(yǎng)細(xì)胞中神經(jīng)元的興奮性和氧化損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)MTT檢測(cè)結(jié)果Hcy干預(yù)組OD值小于對(duì)照組（P值分別為0.010、0.006和0.009，P＜0.05），說明Hcy可抑制N2a細(xì)胞的增殖活力。LDH是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性，發(fā)現(xiàn)Hcy干預(yù)組培養(yǎng)液LDH活性高于對(duì)照組（P值分別為0.013、0.008和0.011，P＜0.05），說明Hcy可對(duì)N2a細(xì)胞膜造成損傷。故光鏡下發(fā)現(xiàn)Hcy干預(yù)組細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組的原因可能為Hcy抑制N2a增殖使產(chǎn)生子代細(xì)胞的數(shù)目減少或者是對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷進(jìn)而引起細(xì)胞死亡數(shù)目增多造成。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase,MAPK）是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其家族成員之一ERK1/2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化，并在神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制中扮演著重要的角色[10-12]。有研究表明，葉酸缺乏可提高培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Hcy的濃度，且葉酸可通過激活ERK1/2磷酸化促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[13-15]。本研究結(jié)果表明，Hcy干預(yù)可減少ERK1/2磷酸化水平抑制神經(jīng)細(xì)胞增殖。鑒于機(jī)體內(nèi)葉酸可作為Hcy代謝的輔助因子，促進(jìn)Hcy合成甲硫氨酸，進(jìn)而降低Hcy水平[17]，同時(shí)，流行病學(xué)研究和臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，腦梗死等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者血清中的葉酸值明顯低于其他病人，而長(zhǎng)期補(bǔ)充葉酸、維生素B6、B12等B族維生素可有效降低Hcy水平，促進(jìn)腦損傷患者神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)、修復(fù)和恢復(fù)，并認(rèn)為這種作用可能與葉酸影響神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡有關(guān)[18]。故我們推測(cè)Hcy濃度的改變可能介導(dǎo)葉酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖作用，葉酸可能通過降低Hcy濃度在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及維持中起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)將為葉酸及Hcy在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過程中作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

[1]HerrmannW,Obeid R.Homocysteine：a biomarker in neurodegenerative diseases[J].Clin Chem Lab Med,2011,49(3)：435

[2]Schalinske K L,Smazal A L.Homocysteine imbalance：a pathologicalmetabolicmarker[J].Adv Nutr,2012,3(6)：755

[3] Wang Fang,Wang Jianhua,Guo Jin,etal.PCMT1 gene polymorphisms,maternal folate metabolism,and neural tube defects：a case-control study in a population with relatively low folate intake [J].GenesNutr,2013,8(6)：581

[4] Lominadze D,Tyagi N,Sen U,et al.Homocysteine alters cerebral microvascular integrity and causes remodelingby antagonizingGABA-A receptor[J].MolCellBiochem,2012,371(1/2)：89[5] Ataie A,Ataee R,Shadifar M,etal.Interaction ofmemantinewith homocysteine on the apoptosis in the rathippocampus cells[J].Int J MolCellMed,2012,1(3)：145

[6] Lee SJ,Kang M H,Min H.Folic acid supplementation reducesoxidative stress and hepatic toxicity in rats treated chronically with ethanol[J].Nutr Res Pract,2011,5(6)：520

[7] Fiorito G,Guarrera S,Valle C,et al.B-vitamins intake,DNA-methylation of One Carbon Metabolism and homocysteine pathway genes and myocardial infarction risk：the EPICOR study[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis,2014,24(5)：483

[8] Guo H Y,Xu F K,LüH T,et al.Hyperhomocysteinemia independently causes and promotes atherosclerosis in LDL receptor-deficientmice[J].JGeriatr Cardiol,2014,11(1)：74

[9]程絲，馮娟，王憲．高同型半胱氨酸血癥治療研究進(jìn)展[J]．生理科學(xué)進(jìn)展，2011，42（5）：329

[10]ParmarM S,Jaumotte JD,Wyrostek SL,etal.RoleofERK1,2,and 5 in dopamine neuron survival during aging[J].Neurobiol Aging, 2014,35(3)：669

[11]Matteucci A,Gaddini L,Villa M,et al.Neuroprotection by rat Müller glia against high glucose-induced neurodegeneration through amechanism involving ERK1/2 activation[J].Exp Eye Res, 2014,125：20

[12]Yang K,Cao F J,Sheikh A M,et al.Up-regulation of Ras/Raf/ ERK1/2 signaling impairs cultured neuronal cellmigration,neurogenesis,synapse formation,and dendritic spine development[J]. Brain StructFunct,2013,218(3)：669

[13]Ortuno-Sahagún D,González R M,Verdaguer E,et al.Glutamate excitotoxicity activates the MAPK/ERK signaling pathway and induces the survivalof rathippocampalneurons in vivo[J].JMolNeurosci,2014,52(3)：366

[14]TürkcüFM,Koz OG,Yarangümeli A,etal.Plasma homocysteine, folic acid,and vitamin B12levels in patientswith pseudoexfoliation syndrome,pseudoexfoliation glaucoma,and normotensive glaucoma [J].Medicina(Kaunas),2013,49(5)：214

[15]Zhang XM,Huang GW,Tian ZH,etal.Folate stimulates ERK1/2 phosphorylation and cell proliferation in fetal neural stem cells[J]. Nutr Neurosci,2009,12(5)：226

[16]Zhang XM,Huang GW,Tian ZH,etal.Folate deficiency induces neuralstem cellapoptosisby increasinghomocysteine in vitro[J].J Clin Biochem Nutr,2009,45(1)：14

[17]Cao H,Hu X H,Zhang Q,etal.Hyperhomocysteinaemia,low folate concentrations and MTHFR C677Tmutation in abdominal aortic aneurysm[J].Vasa,2014,43(3)：181

[18]周小紅，劉向一．腦梗塞患者血清葉酸濃度的改變[J]．中華臨床醫(yī)學(xué)雜志，2006，7（8）：49

（2014-07-30收稿）

Neurotoxicity ofhomocysteineonmouse N2a neuroblastoma cells

GOUYun，HUANGGuo－wei，CHENShuang，ZHANGXu－mei
（DepartmentofNutrition and Food Hygiene，SchoolofPublic Health，Tianjin MedicalUniversity，Tianjin 300070，China）

Objective：Toexplore theneurotoxicityofhomocysteine（Hcy）onmouseneuroblastoma cells（N2a）and itseffecton pERK1/2 protein level．Methods：Cultured N2a cellswere divided into fourgroups according to the concentrations ofhomocysteine：controlgroup（Hcy 0μmol/L），low－Hcy（30μmol/L），moderate－Hcy（300μmol/L），high－Hcy（1 000μmol/L）groups．After72 h Hcy treatment，the toxicity ofN2a cellswasdetected by LDH（lacate dehydrogenase）assay kit，cellproliferation abilitywas detected by MTTmethods，and the protein expression of pERK1/2 was detected by western blot．Results：The LDH activity in Hcy－treated groupswas increased compared with control group（P＜0．05）．The cells proliferation ability was decreased after Hcy treatment，and OD valueswere reduced comparedwith controlgroup（P＜0．05）．Theprotein expression ofpERK1/2 decreased afterHcy treatment，and significantdifferencesamong themoderate，high Hcydosegroupsand controlgroupwere found（P＜0．05）．Conclusion：The toxiceffectofHcyon N2a cellsmaybe caused by reduced ERK1/2 protein phosphorylation expression．Itsuggests thata low serum Hcy levelmay havea protectiveeffecton neuralcells．

homocysteine；mouse；neuroblastoma cell；cellapoptosis；pERK1/2

R15

A

1006－8147（2015）01-0006-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373003）；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014M550148)

茍蕓（1990-），女，碩士在讀，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與神經(jīng)退行性疾病；通信作者：張緒梅，E-m ail:zhangxumei@tijm u.edu.cn。