Ebp1的表達對乳腺癌細胞增殖和侵襲的影響

劉 媛，袁 杰，張 潔，趙元元，牛瑞芳

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060）

論著

Ebp1的表達對乳腺癌細胞增殖和侵襲的影響

劉 媛，袁 杰，張 潔，趙元元，牛瑞芳

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060）

目的：研究降低Ebp1的基因表達水平對乳腺癌細胞T47D野生型增殖能力和侵襲能力的影響。方法：轉染并篩選Ebp1降表達的單克隆細胞株clone1、clone2、clone3，陰性對照組命名為control。應用小干擾RNA（siRNA）技術降低Ebp1的表達，采用Western blotting技術檢測Ebp1蛋白水平的變化,噻唑藍（MTT）比色法和克隆形成實驗觀察其對T47D野生型細胞增殖能力和克隆形成能力的影響;采用Matrigel侵襲實驗研究其對細胞侵襲能力的影響。結果：Western blotting檢測表明siRNA干擾后T47D野生型細胞中Ebp1的蛋白表達水平明顯下降,且與親本和control組細胞比較，Ebp1降表達的細胞克隆的增殖能力和侵襲能力明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：Ebp1表達下降可以明顯促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力，提示Ebp1可能是乳腺癌增殖和侵襲的抑制性因子。

Ebp1；乳腺癌；增殖；侵襲

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的腫瘤之一，而腫瘤的浸潤和轉移是影響治療效果和導致死亡的重要因素[1]。Ebp1是重組人增殖相關蛋白2G4（proliferation-associated 2G4）家族的成員之一，最早是通過酵母雙雜交從生長因子表皮受體3（EGFR3）的跨膜區(qū)域分離得到，并且被鑒定為ErBb3的結合蛋白[2]。Ebp1在乳腺癌[3]、肝癌[4]、前列腺癌[5]等多種腫瘤細胞中表達異常，參與調節(jié)細胞周期和細胞分化，是腫瘤增殖抑制因子。蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）可引起Ebp1的Ser360的磷酸化與ErbB3發(fā)生結合，而當在ErBb3配體HRG的刺激下[6]，Ebp1與ErBb3分離進入細胞核，與轉錄抑制因子Rb[7]、組蛋白脫乙酰酶HDAC2[8]、轉錄抑制因子Sin3A[9]相互作用，形成轉錄抑制復合體，從而導致與增殖相關的蛋白如轉錄因子E2F1、周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E的表達受到抑制。目前Ebp1在乳腺癌中的研究已證實其對乳腺癌細胞MCF-7和AU565增殖的抑制作用[10]，但是其對乳腺癌遷移和侵襲的研究卻較少。本研究利用小干擾RNA（siRNA）技術降低增殖能力和侵襲能力都較弱的乳腺癌細胞T47D野生型中的Ebp1表達，觀察降表達后對T47D野生型細胞的增殖和侵襲能力的影響，探究Ebp1影響乳腺癌增殖和侵襲的分子機制。

1 材料和方法

1.1 siRNA質粒 Ebp1特異性小干擾RNA購自吉凱基因公司，干擾序列為：5′-ATGCAGGACAGAGAACCACTATTTACA-3′，對照組序列為：5′-ATGCCAGCCAGGGAGAGTACAAGGCA-3′[11]，質粒的測序結果顯示與定制序列一致。

1.2 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞T47D野生型（American Type Culture Collection細胞庫）培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMl-1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2環(huán)境中，0.25%的胰酶消化傳代。

1.3 細胞系的建立

1.3.1 質粒轉染 （1）取對數(shù)生長期的T47D野生型細胞以適當密度接種于6孔板內，使其24 h覆蓋率達到90%～95%，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。（2）24 h后用1640培養(yǎng)液將細胞饑餓2 h，以提高轉染效率。（3）將siRNA及對照質粒（序列長度與siRNA相同卻無干擾意義）用Lipofectamine2000（Invitrogen公司）進行轉染。取質粒10μg，轉染試劑4μL分別稀釋于1640培養(yǎng)液，靜置20min后混勻，緩慢滴加到6孔板內，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。（4）轉染6 h后更換新鮮培養(yǎng)液。

1.3.2 穩(wěn)定克隆的篩選 （1）轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，并加入150mg/mL的嘌呤霉素進行篩選，期間依據(jù)細胞狀態(tài)和密度進行換液或傳代。（2）篩選2周后，觀察細胞熒光強度，并以有限稀釋的方法篩選出3珠穩(wěn)定單克隆細胞，分別命名為 clone1、clone2、clone3，對照組命名為control組，嘌呤霉素濃度為篩選濃度的1/2。（3）siRNA的干擾效率以Western blotting檢測。

1.4 Western blotting檢測Ebp1在細胞中的表達將提取的細胞蛋白用SDS-PAGE膠電泳分離并轉移至PVDF膜上。5%牛奶封閉1 h后室溫孵育一抗Ebp1（1∶1 000）（Mi lipore兔抗），β-acti n（1∶2 000）（Santa Cruz鼠抗）2 h，室溫孵育HRP標記的二抗（1∶5 000）（Invit rogen公司）1 h；最后用ECL化學發(fā)光試劑和膠片曝光信號檢測蛋白的表達水平。

1.5 噻唑藍（MTT）檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期的T47D野生型細胞、control細胞和clone1、clone2、clone3分別接種于96孔板中,貼壁后每24 h加入20μL的5mg/mLMTT，繼續(xù)孵育4 h后每孔加150μL二甲基亞砜（DMSO），酶標儀測量570 nm處的吸光度（OD值），連續(xù)檢測5d，每種細胞設置5個復孔，取其OD值的平均值。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力 取對數(shù)生長期的 T47D野生型細胞、control細胞和clone1、clone2、clone3，分別以500個/孔接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)2周，每3～4 d更換新鮮培養(yǎng)液。2周后，棄去培養(yǎng)液，用甲醇固定10min，0.000 5%結晶紫染色30min，顯微鏡下觀察并計數(shù)克隆形成數(shù)目，以>50個細胞為1個克隆。

1.7 Matrigel侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力 將Matrige l（BD公司）在4℃緩慢解凍后與無血清的DMEM培養(yǎng)基以1∶4的比例稀釋，加入T ranswell（24孔），50μL/孔，放入37℃溫箱30min。將150μL的T47D野生型細胞、control細胞和clone1、clone2、clone 3細胞懸液加入上室，細胞濃度為5×105個/ mL，將300μL血清加入下室。37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培育24～36 h。利用三步染色試劑盒染色。在倒置顯微鏡下計數(shù)過膜細胞，光鏡下（200×）隨機選擇5個視野計數(shù)取平均值。

2 結果

2.1 質粒轉染效率驗證 轉染48 h后siRNA及對照質粒的轉染效率如圖1所示，siRNA及control組轉染效率都在60%以上。clone1、clone2、clone3經(jīng)過嘌呤霉素篩選后熒光細胞比例高達95%～100%，證明轉染及篩選成功。

圖1 干擾質粒及對照質粒的轉染效率Fig1 The transfection efficiency of sm all interference plasm id and control

2.2 siRNA干擾T47D野生型細胞中Ebp1的表達水平 Western blotting結果顯示，與T47D野生型比較，應用特異性小干擾RNA處理挑取的3個克隆細胞株中Ebp1表達量明顯降低，而對照組則沒有差異（圖2）。

圖2 W estern blotting檢測Ebp1的表達Fig 2 Theexpression of Ebp1 detected by western blotting

2.3 降表達Ebp1增強T47D野生型細胞的增殖能力 用MTT法分別檢測T47D野生型、control組和clone1、clone2、clone3細胞在 0、24、48、72、96 h的OD值，繪制生長曲線圖（圖3），結果顯示穩(wěn)定細胞系在72、96 h的生長速度明顯高于T47D野生型和control組細胞（P＜0．05），而T47D野生型和對照組細胞間的增殖差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。證明Ebp1的蛋白水平降低對T47D野生型細胞的增殖具有明顯促進作用。

圖3 實驗組和對照組細胞的生長曲線Fig 3 The proliferation grow th curves of T47D wild type,control, clone1,clone2 and clone3 cells

2.4 降表達Ebp1促進T47D野生型細胞的克隆形成能力 克隆形成計數(shù)結果顯示，與T47D野生型和對照組比較，clone1、clone2、clone3細胞的克隆數(shù)目明顯增多（圖4），且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而對照組與T47D野生型之間無明顯差異（P>0.05），克隆直徑也有明顯的增加。表明降低Ebp1的蛋白表達提高了乳腺癌細胞系T47D野生型的克隆形成能

圖4 各組細胞的克隆形成數(shù)目Fig 4 The colony num ber of T47D and cloneswhich down-regulated of theexpression of Ebp1

2.5 降表達Ebp1提高T47D野生型細胞的侵襲能力 T47D野生型和control組細胞穿透Matrigel的細胞數(shù)目明顯低于clone1、clone2、clone3細胞,且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。而T47D野生型組與control組比較無明顯差異（P＞0.05），結果顯示干擾Ebp1的基因表達明顯提高了T47D野生型細胞的侵襲能力（圖5）。

圖5 干擾Ebp1促進T47D細胞的體外侵襲能力（×200）Fig 5 The deletion of Ebp1 result in the increaseof invasion ability of T47D cells（×200）

3 討論

目前乳腺癌的治療手段主要是手術、放化療，但是預后的效果卻并不理想，這主要是由于腫瘤的浸潤和轉移，因此研究乳腺癌浸潤和轉移的分子機制對于提高治療效果意義重大[12]。此外，腫瘤細胞的惡性增殖的分子機制也是目前探究腫瘤治療的熱點。Ebp1，ErbB3結合蛋白之一，被證實是腫瘤的抑制因子，其發(fā)生核轉位后與Rb、Sin3A、HDAC2形成轉錄抑制復合體，對腫瘤的增殖和遷移有重要的影響。研究報道，Ebp1在ErBb2/3陽性的乳腺癌細胞AU565中的表達明顯增高，導致細胞G2/M期阻滯和分子分化，是乳腺癌增殖的抑制因子[10]。但是，Ebp1對乳腺癌浸潤轉移的影響尚不明確，因此，本研究著重研究了Ebp1對非浸潤性乳腺癌細胞系T47D野生型的增殖和侵襲能力的影響。

Ebp1在肝癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤組織中表達均降低，降表達后腫瘤細胞的增殖能力顯著增強，本文我們特異性干擾T47D野生型細胞中Ebp1的蛋白表達量，MTT實驗結果和克隆形成實驗結果都表明Ebp1降表達后T47D野生型的增殖能力有明顯的增強作用，說明Ebp1是乳腺癌增殖的抑制因子。但是，我們又發(fā)現(xiàn)，干擾Ebp1的基因表達水平后，T47D野生型細胞的侵襲能力也有明顯地提高。研究報道在唾液腺樣囊性癌轉移病灶包括淋巴、肺和神經(jīng)組織中Ebp1含量低于原發(fā)病灶，表明Ebp1與腫瘤細胞的遷移呈負相關[13]，同樣的結論在肝癌[14]、前列腺癌[15]等腫瘤中也得到證實。我們的研究也證明在乳腺癌中Ebp1的降表達促進腫瘤的遷移和侵襲。在腺樣囊性癌中證實Ebp1與MMP-9（金屬蛋白酶9）和E-cadherin的表達呈負相關[13]，因此推測Ebp1影響T47D野生型細胞的遷移和侵襲可能通過MMPs的激活和上皮間質轉化，但是需要進一步的研究證實。

綜上所述，本研究證實Ebp1的表達量下降后導致乳腺癌細胞增殖和侵襲能力增強，而其中的分子機制尚不明確。但是，Ebp1對乳腺癌的影響為探究腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療提供了新的思路。

[1]Zheng H,LiY,Wang Y Z,etal.Downregulation ofCOX-2 and CYP 4A signaling by isoliquiritigenin inhibits human breast cancer metastasis through preventing anoikis resistance,migration and invasion[J].Toxicol ApplPharmacol,2014,280(1)：10

[2] Yoo JY,Wang X W,Rishi A K,et al.Interaction of the PA2G4 (EBP1)proteinwith ErbB-3 and regulation of thisbindingby heregulin[J].Br JCancer,2000,82(3)：683

[3]Lu Y,Zhou H,ChenW,etal.The ErbB3 bindingprotein EBP1 regulates ErbB2 protein levels and tamoxifen sensitivity in breast cancer cells[J].BreastCancer Res Treat,2011,126(1)：27

[4] Hu B Y,Xiong Y C,Ni R Z,et al.The downregulation of ErbB3 binding protein 1(EBP1)isassociated with poor prognosisand enhanced cell proliferation in hepatocellular carcinoma[J].Mol Cell Biochem,2014,396(1/2)：175

[5] Zhang Y,Linn D,Liu Z,etal.EBP1,an ErbB3-binding protein,is decreased in prostate cancer and implicated in hormone resistance [J].MolCancer Ther,2008,7(10)：3176

[6] Liu ZX,Ahn JY,Liu X,etal.Ebp1 isoforms distinctively regulate cellsurvivaland differentiation[J].Proc Natl Acad SciU SA,2006, 103(29)：10917

[7] Zhang Y,Woodford N,Xia X,et al.Repression of E2F1-mediated transcription by the ErbB3 binding protein Ebp1 involves histone deacetylases[J].Nucleic AcidsRes,2003,31(8)：2168

[8]Akinmade D,Lee M,Zhang Y X,etal.Ebp1-mediated inhibition of cell growth requires serine 363 phosphorylation[J].Int JOncol, 2007,31(4)：851

[9]Ghosh A,AwasthiS,Hamburger AW.ErbB3-binding protein EBP1 decreases ErbB2 levels via a transcriptionalmechanism[J].Oncol Rep,2013,29(3)：1161

[10]Zhang Y X,Akinmade D,Hamburger AW.Inhibition of heregulin mediated MCF-7 breast cancer cell growth by the ErbB3 binding protein EBP1[J].Cancer Lett,2008,265(2)：298

[11]Kim CK,Nguyen TL,Joo KM,etal.Negative regulation ofp53 by the long isoform of ErbB3 binding protein Ebp1 in brain tumors[J]. Cancer Res,2010,70(23)：9730

[12]Chen JJ,Peck K,Hong TM,et al.Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancermodel[J].Cancer Res,2001,61 (13)：5223

[13]Sun J,Luo Y X,Tian Z,etal.Expression of ERBB3 binding protein 1(EBP1)in salivary adenoid cystic carcinomaand its clinicopathological relevance[J].BMCCancer,2012,12：499

[14]Zhang Y X,Ali T Z,Zhou H,et al.ErbB3 binding protein 1 repressesmetastasis-promoting gene anterior gradient protein 2 in prostate cancer[J].Cancer Res,2010,70(1)：240

（2014－08－11收稿）

Influence of the expression of Ebp1 on the proliferation and invasion of breast cancer cells

LIUYuan,YUAN Jie,ZHANG Jie,ZHAOYuan-yuan,NIURui-fang
（Cancer Instituteand Hospital Tianjin Medical University,NationalCancer ClinicalMedicine Research Center，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China）

Objective：Tostudy the influenceof theexpression ofEbp1 on theproliferation and invasion ofbreastcancer cells.Methods：Western blotting and siRNAwere applied to inspectand down-regulate the expression of Ebp1.The effectofproliferation and invasion of T47Dwild type cellswasexamined by MTT assay,colony formation assay and transwellassay respectively.Results:The proliferation and invasion of T47D wild type could be promoted by knock-down of Ebp1 as compared towild type group and control group（P＜0.05）.Conclusion:Down-regulation of Ebp1 facilitates the proliferation and invasion ofbreast cancer cellswhich suggest thatEbp1may be an inhibiting factor forbreastcancer.

Ebp1;breastcancer;proliferation;invasion

R737.9

A

1006－8147（2015）01-0014-04

劉媛（1987-），女，碩士在讀，研究方向：乳腺癌增殖和侵襲的分子機制研究；通信作者:牛瑞芳，E-mail:niurfl982@yahoo. com.cn。