腰椎損傷疝出型椎間盤組織JNK信號通路激活情況的研究

李鵬飛，馬信龍，王 濤，田 鵬，韓 超，臧加成，孔敬波

（1.天津醫科大學總醫院骨科，天津300052；2.天津市天津醫院骨科研究所生物力學室，天津300211）

論著

腰椎損傷疝出型椎間盤組織JNK信號通路激活情況的研究

李鵬飛1，2，馬信龍2，王 濤2，田 鵬2，韓 超2，臧加成2，孔敬波2

（1.天津醫科大學總醫院骨科，天津300052；2.天津市天津醫院骨科研究所生物力學室，天津300211）

目的：探究c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路在腰椎損傷疝出型椎間盤組織中激活情況。方法：隨機選擇24例行手術治療的腰椎間盤突出癥（LDH）患者，其中12例損傷疝出型和12例退變突出型，分別為損傷疝出組和退變突出組。收集術中摘除的椎間盤組織，HE染色觀察髓核組織病理變化；TUNEL染色分析髓核細胞凋亡情況；免疫蛋白印跡技術檢測MKK4、JNK、pJNK、JunD蛋白表達水平。結果：損傷疝出組出現炎性細胞浸潤的比例、髓核細胞凋亡計數以及MKK4、JNK、pJNK、JunD蛋白表達水平高于退變突出組（P<0.05）。結論：損傷疝出型髓核組織炎癥反應更明顯；JNK信號通路異常激活與髓核細胞凋亡增加可能是損傷疝出型LDH病理機制之一；JNK信號通路激活可能是LDH病理分型的標志之一。

腰椎；椎間盤移位；JNK信號通路

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniatio n，L DH）是以腰痛、坐骨神經痛等為主要臨床表現的骨科常見病，其發病機制存在爭議，機械壓迫學說[1]、化學性神經根炎學說[2]以及自身免疫學說[3]是目前存在的3個熱點學說，但其詳細機制尚不明確。研究LDH的病理機制，首先應該認清LDH的分型，不同分型的LDH的病理機制不同，其手術方案亦不相同。目前公認的LDH的病理學分型是損傷疝出型和退變突出型[4-6]，是基于LDH的自身免疫學說，而非解剖學分型。本課題組前期實驗中采用生物芯片技術篩選出腰椎間盤突出癥髓核組織microRNAs表達譜[7]，其中miR-494和miR-513a-5p在損傷疝出型LDH中較退變突出型高表達，其靶基因分別是c-Jun氨基末端激酶（JNK）的上游MKK4和下游JunD，因此我們預測JNK信號通路可能調節LDH的病理過程。JNK是促分裂原活化蛋白激酶家族成員之一，研究證實細胞因子、應激、生長因子等可以激活JNK通路，調節細胞的增殖、凋亡、分化，并在許多疾病中發揮重要作用[8-10]。本試驗目的是進一步驗證腰椎損傷疝出型椎間盤組織JNK信號通路激活情況，探討JNK信號通路在損傷疝出型LDH病理過程中可能的機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 納入標準和排除標準 納入標準：（1）根據臨床表現、影像學資料（X線、CT、MRI）確診為LDH；（2）反復發作，經過3個月保守治療無法緩解癥狀，須行手術治療；（3）根據影像學資料和術中所見纖維環的完整性將病例分為損傷疝出型和退變突出型。排除標準：（1）腫瘤、感染、自身免疫疾病等；（2）術前使用免疫抑制劑。

1.1.2 臨床資料 依據上述標準隨機選擇2012年5月-10月天津市天津醫院脊柱外科確診并行手術治療的LDH患者24例，分為12例損傷疝出型和12例退變突出型，分別為損傷疝出組和退變突出組。損傷疝出組男性8例，女性4例，年齡（41．83±13．55）歲，L4/L5 6例，L5/S1 6例；退變突出組男性7例，女性5例，年齡（54．17±11．36）歲，L2/L3 1例，L4/L5 7例，L5/S1 4例。收集手術摘除的間盤組織，仔細分離棄去纖維環和軟骨，將獲得的髓核組織裝入凍存管，0℃保存并在0.5 h內送到實驗室液氮保存。

損傷疝出型LDH診斷標準[6]：（1）患者以中青年為主，多存在腰部扭轉暴力外傷病史，坐骨神經痛明顯，直腿抬高試驗陽性；（2）MRI顯示病變椎間盤T2加權像呈低信號，髓核突破纖維環及后縱韌帶，椎間盤突出于椎管內壓迫神經根；（3）術中發現纖維環及后縱韌帶破裂，髓核組織與椎間盤母體分離，質軟，常自行溢出或很容易用髓核鉗拉出。

退變突出型LDH診斷標準[6]：（1）患者多為老年人，有中、重體力勞動史，一般無腰部外傷史，以間歇性跛行為典型癥狀，亦可出現直腿抬高試驗陽性；（2）MRI顯示為多發腰椎間盤變性突出或膨出，以某節段為主，但纖維環及后縱韌帶完整；（3）術中發現纖維環及后縱韌帶完整，椎間盤質硬，切開纖維環，髓核組織也不會突出，也不容易用髓核鉗拉出。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 PB S（Cwbio公司，美國），二甲苯（北京化學試劑公司，中國），無水乙醇（北京化學試劑公司，中國），改良型蘇木精（Cwbio公司，美國），中性樹膠（Cwbio公司，美國），TUNEL試劑盒（博士德公司，中國），DAB顯色試劑盒（Cwbio公司，美國），組織蛋白抽提試劑盒（Cwbio公司，美國），BCA定量檢測試劑盒（Cwbio公司，美國），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Cwbio公司，美國），EeclWestern Blot Kit高靈敏度化學發光檢測試劑盒（Cwbio公司，美國），Western Blot封閉液II（Cwbio公司，美國），麗春紅染色試劑（Cwbio公司，美國），MKK4、JNK、p-JNK、JunD一抗（Cwbio公司，美國），β-actin鼠單克隆抗體（Cwbio公司，美國），Mar ker（Cw bio公司，美國）。

1.2.2 主要儀器 顯微鏡及顯微成像系統（Olympus BX41，日本），液氮罐（Thermo公司，美國），石蠟組織切片機（Leica2235，德國），生物組織攤烤片機（亞光YT-6C，德國），蛋白電泳系統（Hoefer SE250，美國），蛋白轉膜系統（Hoefer TE22，美國），化學發光成像系統（Fusion X7型，美國）。

1.2.3 組織學觀察 組織置于4%多聚甲醛固定48h，石蠟包埋，切片機連續切片，每個樣本切10張完整的片子，厚度6μm，脫蠟水化，選擇5張切片進行伊紅-蘇木精（HE）染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，晾干，顯微成像系統拍照（×200）。

1.2.4 TUNEL染色分析凋亡情況 選擇余下5張脫蠟水化后的石蠟切片行TUNEL染色，首先每個樣本滴加50mL PBS稀釋的2mg/mL的蛋白酶K溶液，37℃孵育15min，PBS洗滌（必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應），每張片加入50μL TdT反應混合液，37℃放置2 h，PBS洗滌，封閉液封閉30min，然后滴加生物素化抗地高辛抗體（SABC）,37℃孵育30min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，封片，晾干，顯微鏡觀察拍照，每個樣本每張片子選擇10視野計數凋亡細胞，并計算平均數。

1.2.5 免疫蛋白印跡法檢測JNK通路激活情況 將髓核組織置于冰上碾碎后加入哺乳動物蛋白抽提試劑并混勻，冰上孵育20min，定量檢測樣本蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移到0.22μm孔徑的硝酸纖維素膜（NC膜），麗春紅染色，Western Blot封閉液II（含5%脫脂奶粉）封閉NC膜2 h，分別加入1∶500稀釋的一抗MKK4、JNK、pJNK及JunD，室溫孵育1 h，4℃過夜，加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育40 min，TBST洗膜5次，每次5min，2mLECTWestern BlotKit高靈敏度化學發光檢測試劑避光孵育2min后FusionX7化學發光成像系統曝光，β-actin作內參。Gel-Pro32圖像分析軟件計算分析條帶的灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據處理，所有計量資料用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料組間比較采用Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 HE染色發現損傷疝出組有9例發現炎性細胞浸潤，而退變突出組只有2例，使用確切概率法比較兩組差異性，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖1）。

圖1 兩組標本HE染色（×200）Fig 1 HE-stained sam plesof two groups(x200)

2.2 TUNEL染色檢測髓核細胞凋亡情況 TUNEL染色切片發現：損傷疝出組凋亡細胞計數（14.3± 2.7）明顯多于退變突出組（8.3±2.6）（圖2），差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.3 Western Blot檢測JNK信號通路激活情況 損傷疝出組JNK信號通路中MKK4、JNK、pJNK、JunD蛋白表達水平較退變突出組明顯高表達（圖3），差異具有統計學意義（P<0．05）（表1）。

表1 兩組標本JNK信號通路蛋白定量結果（OD值570mm）Tab 1 The result of protein quantify of JNK pathway signaling in two groups(OD value,570mm)

圖2 兩組樣本TUNEL染色（×400）Fig 2 TUNEL-stained samplesof two groups（×400）

圖3 兩組中JNK信號通路蛋白表達水平Fig 3 Situation of expression of JNK signaling pathway proteins in two groups

3 討論

3.1 腰椎損傷疝出型椎間盤組織炎癥反應更明顯 HE染色結果發現損傷疝出組髓核組織出現炎性細胞浸潤的比例更高，說明炎癥反應明顯，然而引起炎癥的原因很多，如物理、化學、生物學以及免疫學等因素，由免疫學因素介導的炎癥稱為免疫炎癥。基于腰椎間盤的特殊解剖結構，Naylor等[3]1962年首先提出LDH的自身免疫學說,認為無血運的髓核組織是人體的“隱蔽”抗原，髓核從椎間盤中脫出接觸人體血液系統可以誘發自身免疫反應，大量實驗已經證實了LDH自身免疫反應的存在[11-12]，但僅在損傷疝出型LDH椎間盤組織標本中發現CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤和免疫球蛋白IgG、IgM的沉積[4-13]，以及IL-1、IL-6、IL-8、IL-17等[14-16]炎癥因子的高表達。本研究納入的損傷疝出型LDH患者大都存在腰部扭轉暴力外傷史，而且術中發現纖維環破裂，髓核脫出，因此推斷炎癥細胞的浸潤可能是由于脫出的髓核引發的自身免疫反應導致的，自身免疫因素在LDH尤其是損傷疝出型LDH發病機制、病理演變以及癥狀產生過程中可能發揮重要作用。

3.2 JNK信號通路在損傷疝出型腰椎間盤突出癥病理機制中可能的作用 本研究發現損傷疝出型椎間盤組織MKK4、JNK、pJNK及JunD蛋白表達水平以及髓核細胞凋亡數高于退變突出型。JNK信號通路作用機制復雜，生物效應多變，具有促凋亡和抗凋亡的雙重作用[17]，JNK可直接磷酸化Bcl促凋亡家庭成員（如Bak和Bid），介導線粒體釋放促凋亡因子，從而誘導細胞凋亡[18-19]，JNK還可以激活JunD，而JunD通過下游的NF-kB信號通路或PI3K/AKT信號通路促進細胞生存[20]。有文獻報道[9]，IL-1和NO通過激活MAPK信號通路（ERK1/2，JNK，p38）來誘導髓核細胞的凋亡。董振輝等[21]研究發現TNF-α介導JNK信號通路誘導髓核細胞凋亡。JNK信號通路的異常激活可能是損傷疝出型LDH自身免疫引發的炎癥反應所致，髓核細胞凋亡增加可能與JNK信號通路的異常激活密切相關，而JunD蛋白的高表達可能是髓核細胞凋亡的保護機制，試圖平衡JNK引起的凋亡，但均需進一步的細胞實驗進行驗證。因此，我們得出結論，JNK信號通路異常激活與髓核細胞的凋亡增加可能是損傷疝出型腰椎間盤突出癥病理機制之一。

3.3 JNK信號通路的異常激活在腰椎間盤突出癥病理分型中的意義 目前LDH的病理分型存在爭議，大部分分型是基于突出椎間盤的形態和位置，不是真正意義的病理分型。國際腰椎研究會（ISSLS）和美國矯形外科協會（AAOS）將腰椎間盤突出癥分為退變型、膨出型、突出型、后縱韌帶下脫出型、后縱韌帶后脫出型及游離型。MacNab[22]將其分類為：（1）突出，包括局限型和廣泛型；（2）疝出，包括脫垂、脫出和游離型。該分類可以認為概括了LDH的兩種病理類型。Spengler[23]分類：突起型、突出型、游離型。周秉文等[24]分類：突起型、破裂型、游離型。張義修[25]按照椎間盤突出的病理學實質，將其分為3類：椎間盤損傷疝出型、椎間盤退行性膨出、椎體后緣骨軟骨病。本研究發現損傷疝出型LDH椎間盤組織JNK信號通路激活情況明顯高于退變突出型，進一步說明損傷疝出型和退變突出型LDH是兩種不同的病理變化，有希望成為LDH病理分型的標志物。

綜上所述，JNK信號通路異常激活與髓核細胞凋亡增加可能是損傷疝出型腰椎間盤突出癥病理機制之一，針對JNK信號通路的靶向生物治療意義重大。另一方面有望鑒別LDH病理分型，指導LDH的手術方案。本研究也存在不足之處，納入樣本偏少，需要加大樣本進行驗證，并進一步在細胞水平上深入研究。

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（2014-07-14收稿）

JNK signaling pathway in disc tissueof injury-extrusion typeof lumbar disc herniation

LIPeng-fei1,2,MA Xin-long2,WANGTao2,TIANPeng2,HANChao2,ZANG Jia-cheng2,KONG Jing-bo2
（1．D epartment of Orthopaedics，General Hospital，Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;2.Biomechanics laboratory of Orthopaedic Research Institute of Tianjin Hospital,Tianjin 300211,Chin a）

Objective:To investigate the function ofc-Jun N-terminalkinase(JNK)signaling pathway in disc tissueof injury-extrusion typeoflumbardischerniation(LDH).Methods:Twenty fourcaseswith LDHwere randomly chosen,ofwhich 12 caseswere injury-extrusion type(injury-extrusiongroup)and 12 casesweredegeneration-protrusion type(degeneration-protrusion group).Disc tissuewascollected duringoperation,and thepathologicalchangesofnucleuspulposustissuewith HEstainingwereobserved;theapoptosisofnucleuspulposus cellswith TUNEL stainingwere analyzed;the expression levelsofMKK4,JNK,pJNK,JunD protein withWestern blottingwere detected.Results:The proportion of inflammatory cells infiltration,the countofnucleuspulposuscellsapoptosisand theexpression levelsofMKK4, JNK,pJNK,JunD protein of injury-extrusion group were significantly higher than degeneration-protrusion group(P<0.05).Conclusion:Local inflammation ofnucleuspulposus tissue for injury-extrusion group ismore significant;Abnormalactivation of JNK signaling pathway and increaseofnucleuspulposuscellsapoptosismay be the pathologicalmechanism for injury-extrusion typeof LDH;Abnormalactivation of JNK signaling pathwaymaybeamarker forpathologicalclassification of LDH.

lumbar vertebrae;intervertebraldisk displacement;JNK signaling pathway

R681.5+3

A

1006－8147（2015）01-0035-04

天津市科技支撐重點項目（13ZCZDSY01700）

李鵬飛（1987-），男，碩士在讀，研究方向：脊柱外科；通信作者：馬信龍，E-mail:m axin long86@163.com。